復(fù)方紅景天緩解體力疲勞活性的研究

甘昌勝，王珊珊，李 鴻，蔡坤良

（合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥230009）

疲勞是涉及許多生理生化因素的綜合性生理過程，是機體體力或腦力活動達到一定階段時出現(xiàn)的正常生理現(xiàn)象。但若疲勞長時間得不到有效緩解，會對肌體產(chǎn)生一系列傷害，甚至導(dǎo)致器質(zhì)性疾病，威脅人類健康。

紅景天作為我國傳統(tǒng)的藏藥，藥用歷史悠久，常生長在高寒缺氧地帶[1]，可在極其惡劣多變的自然環(huán)境中生長，造就了其獨特的抗輻射、耐缺氧、抗疲勞、延緩人體衰老等功效，被譽為“高原人參”[2-5]。目前，紅景天的抗疲勞活性已有一些報道，筆者也對紅景天的活性成分及其提取物的抗疲勞活性進行了系列研究，表明具有較強的抗疲勞效果。

疲勞是一個受多重因素影響的復(fù)雜過程，中藥單體一般作用比較單一，難以達到綜合調(diào)理的效果，而且，紅景天作為一種名貴珍稀藥用植物，成本高，藥價貴，適用群體有限。關(guān)于單味中藥的實驗報道較多見，檢索了在文獻中經(jīng)常出現(xiàn)的具有抗疲勞活性的中藥，發(fā)現(xiàn)多以滋補類中藥為主，其中，補氣的有人參、刺五加、紅景天、靈芝、枸杞、五味子、黃精、大棗、黃芪、何首烏、絞股藍(lán)等，補血活血的有三七、當(dāng)歸、阿膠、丹參等，還有補腎陽的中藥，如淫羊藿、巴戟天、肉蓯蓉、鹿茸等。作為中醫(yī)藥的一大特色，中藥復(fù)方能夠從不同側(cè)面促進疲勞的緩解，綜合調(diào)理，以有機的整體來認(rèn)識人與疲勞的關(guān)系，注重疲勞產(chǎn)生的綜合性和復(fù)雜性，調(diào)補相結(jié)合，使機體達到新的平衡，從而消除疲勞，恢復(fù)體力，具有其他單方或單味中藥無法比擬的優(yōu)勢[6-8]。

本研究從補氣和補血活血入手，輔以補腎陽，從上述常用的抗疲勞中藥中選擇了枸杞、黃精、五味子、當(dāng)歸和肉蓯蓉，整體組方性平，久服不會燥熱上火，且大多為藥食同源的植物資源，即使長期服用，安全性也很高。論文在前期紅景天抗疲勞功能的基礎(chǔ)上，添加這幾味中藥復(fù)配組成復(fù)方，通過動物實驗，研究復(fù)方對抗疲勞活性的增強效果，并進一步研究與運動小鼠的能量代謝密切相關(guān)的幾種酶活性的變化，探討抗疲勞機制，為保健品開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大花紅景天（Rhodiola crenulata）根，西藏林芝；當(dāng)歸 （Angelica sinensis），甘肅岷縣；多花黃精（Polygonatum cyrtonemaHua）， 安徽霍山； 枸杞（Lycium barbarumL.），寧夏中寧；肉蓯蓉（Cistanche deserticolaY.C.Ma），內(nèi)蒙古阿拉善；北五味子（Schisandra chinensis（Turcz.） Baill），河北承德。 中藥材均購自合肥大藥房。生化測試試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。色譜純乙腈、甲醇，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；水為超純水；其余試劑均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

UV-1600型紫外分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；FW177型中草藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；RE52CS-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

健康雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量20.0±2.0 g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，同室分籠飼養(yǎng)一周，環(huán)境溫度控制在25±2℃，光照12/24 h。

1.2 實驗方法

1.2.1 復(fù)方中各味中藥材浸膏的制備 1）紅景天浸膏的制備。稱取10 g已粉碎的大花紅景天粉末，按照前期已優(yōu)化出的提取條件，70%乙醇、料液比1∶15、75℃提取3 h。減壓過濾，收集濾液，減壓濃縮，回收乙醇，得紅景天浸膏。

2）五味子浸膏的制備[9]。稱取20 g粉碎后的五味子，選擇 70%乙醇、料液比 1∶10、75 ℃提取 2 h，減壓過濾，收集濾液；濾渣在同前的條件下再提取一次，合并兩次收集的濾液，減壓濃縮，得五味子浸膏。

3）枸杞浸膏的制備[10]。稱取5g粉碎后的枸杞，加入20倍體積的水，80℃提取2h。減壓過濾，收集濾液，減壓濃縮，得枸杞浸膏。

4）黃精浸膏的制備[11]。稱取10 g黃精，粉碎，加入15倍體積水，90℃提取2 h。收集濾液，減壓濃縮，得黃精浸膏。

5）肉蓯蓉浸膏的制備[12]。稱取10 g肉蓯蓉，選擇60%乙醇、料液比1∶15、80℃提取2 h，提取2次。合并濾液，減壓濃縮，回收乙醇，得肉蓯蓉浸膏。

6）當(dāng)歸浸膏的制備[13]。稱取10 g粉碎后的當(dāng)歸粉末，加入10倍量水，80℃提取2次，第一次3 h，第二次2 h。合并濾液，濾液旋蒸濃縮，得當(dāng)歸浸膏。

1.2.2 復(fù)方中各味中藥活性成分含量的測定 據(jù)2010版《中國藥典》，紅景天中的紅景天苷、五味子中的五味子醇甲、枸杞子和黃精中的多糖、肉蓯蓉中的松果菊苷、當(dāng)歸中的阿魏酸是其主要的代表性活性成分。其中紅景天苷、五味子醇甲、松果菊苷、阿魏酸采用HPLC檢測[9-16]，枸杞多糖和黃精多糖含量由苯酚硫酸法測定[14]。

1）紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。HPLC條件。流動相：甲醇∶水=20∶80，檢測波長：275 nm，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL；流速：1.00 mL/min。 分別配制質(zhì)量濃度 為 0.057 8、0.115 6、0.231 2、0.578、1.156、1.734mg/mL的紅景天苷甲醇溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程：

2）五味子醇甲標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。HPLC條件。流動相：甲醇∶水=65∶35，檢測波長：250 nm，柱溫：30℃，進樣量：10 μL。 配制質(zhì)量濃度為 0.010 3、0.031、0.051 5、0.103、0.152、0.206、0.31 mg/mL 的溶液，進樣檢測，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程：y=2197 9x+23.604（R2=0.999 7）。

3）松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。HPLC條件。流動相：26.5（甲醇）∶73.5（0.1%甲酸溶液），梯度洗脫 0～17 min；29.5∶70.5，17～27 min。 檢測波長：330 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min。 配制質(zhì)量濃度為 0.025、0.05、0.1、0.2 和 0.4 mg/mL 的松果菊苷溶液，進樣檢測，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程：y=1 328.7x+25.385（R2=0.999 9）。

4）阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。HPLC條件。流動相：乙腈∶水=17∶83；檢測波長：316 nm；進樣量：10 μL；柱溫：35℃。配制質(zhì)量濃度為 0.025 9、0.051 8、0.077 8、0.103 7、0.129 6、0.259 2、0.388 8、0.518 4mg/mL的阿魏酸甲醇溶液。在設(shè)定的色譜條件下進行分析，以阿魏酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程：y=32 790x+430.13（R2=0.998 2）。

5）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。配制質(zhì)量濃度為5、20、35、50、65 μg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。 分別吸取2.0 mL上述不同質(zhì)量濃度的葡萄糖溶液，置于20 mL試管中，每支試管中加入1.00 mL 5%的苯酚，搖勻后緩慢滴加5.00 mL的濃硫酸。搖勻，靜置20 min，蒸餾水作空白對照，在486 nm處測定各管吸光度。測量結(jié)果對葡萄糖質(zhì)量濃度做線性回歸，回歸方程為y=0.013 7x+0.081 9（R2=0.999 7）。

1.2.3 復(fù)方設(shè)計 將制得的各味中藥浸膏，加水定容至100 mL，得到各味中藥的水溶液，配方以水溶液的體積進行配比。所有配方中含有的生藥材總量都是4 g，各復(fù)方中不同組分混合后，都加水稀釋至60 mL，保持與紅景天單方同樣的料液比1∶15（表1）。

表1 復(fù)方組成Table 1 Composition of the compounds

1.2.4 復(fù)方紅景天抗疲勞活性的測定[17]1）小鼠分組。小鼠隨機分成6組，每組40只，分別是安靜對照組、運動對照組、配方一組、配方二組、配方三組、紅景天單方組（將1.2.1節(jié)中所得紅景天浸膏加150 mL水復(fù)溶），分別灌以生理鹽水、配方一、配方二、配方三溶液、紅景天提取物溶液，以12 mL/kg（體質(zhì)量）灌胃，每日一次，連續(xù)灌胃30 d。每半個月記錄小鼠體質(zhì)量。

2）負(fù)重游泳實驗[17]。末次灌胃30 min后，每組隨機取出10只小鼠，在小鼠尾部綁上其體質(zhì)量5%的鉛皮，放入水深30 cm左右、水溫25±0.5℃的水箱中游泳，記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間，作為小鼠力竭游泳時間。

3）血清尿素氮的測定[17]。末次灌胃30 min后，每組隨機取出10只小鼠，置于30℃的水中無負(fù)重游泳90 min后取出，休息60 min，摘眼球采血0.5 mL。待凝固后離心，取血清待測，具體測定方法按照南京建成試劑盒測定。

4）血乳酸測定[17-18]。末次灌胃30 min后，每組隨機取出10只小鼠，負(fù)重2%體質(zhì)量在30℃的水中游泳60 min，安靜15 min后采血備用。取小鼠全血0.1 mL，加入蛋白沉淀劑0.6 mL混勻，4 000 r/min離心10 min，取上清液待測，具體測定方法按照南京建成試劑盒測定[19]。

5）肝糖元測定[17，20]。末次灌胃 30 min 后，每組隨機取出10只小鼠，無負(fù)重置于水溫30℃的水中游泳90 min后，立即頸椎脫臼處死。取出肝臟，生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，稱取肝組織50 mg，加入150μL 30%NaOH溶液，沸水浴20 min，加0.8 mL水，混勻，制成5%反應(yīng)液，取反應(yīng)液0.5 mL加水0.5 mL，混勻，加蒽酮試劑 2 mL，沸水浴 5 min，620 nm比色，按南京建成試劑盒要求測定。

1.2.5 復(fù)方紅景天對運動小鼠能量代謝相關(guān)酶活的影響 小鼠運動方式同肝糖元的測定，運動后，立刻處死。取肝臟、血或肌肉組織測試琥珀酸脫氫酶（SDH）、肌酸激酶（CK）、三磷酸腺苷（ATP）酶活。

SDH酶活測定：取小鼠肝組織勻漿上清和肌肉組織勻漿上清，按照南京建成試劑盒要求操作，在600 nm處比色，計算5和65 s時的吸光度值差值[20-22]。

CK酶活測定：取小鼠肌肉組織勻漿上清，加生理鹽水稀釋為0.25%的勻漿。取20 μL 0.25%的肌肉組織勻漿，按照南京建成試劑盒說明書測定[21-23]。

ATP酶活測定：稱取0.1 g肌肉組織加入0.8mL生理鹽水，制備勻漿，1 500 r/min離心l0 min，取上清0.2 mL加0.8 mL生理鹽水稀釋成2%組織勻漿，取200 μL測ATP酶活性，具體操作見南京建成試劑盒說明書[21-23]。

蛋白定量：采用考馬斯亮蘭染色法，具體操作見南京建成考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒說明書[24]。

1.2.6 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x0±s）表示，結(jié)果采用方差分析進行組間檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)方中藥材各活性成分測定結(jié)果

依據(jù)各活性成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得紅景天溶液中紅景天苷的質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL，五味子溶液中五味子醇甲的質(zhì)量濃度為0.85 mg/mL，枸杞溶液中枸杞多糖的質(zhì)量濃度為2.51 mg/mL，黃精溶液中黃精多糖的質(zhì)量濃度為3.34 mg/mL，肉蓯蓉溶液中的松果菊苷質(zhì)量濃度為1.56 mg/mL，當(dāng)歸溶液中的阿魏酸質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL。從而，可以進一步計算出各組方中不同代表性活性成分的質(zhì)量濃度，如表2所示。

表2 各組方中代表性活性物質(zhì)的含量Table 2 Content of representative active substances in the prescription

2.2 復(fù)方紅景天抗疲勞實驗結(jié)果

2.2.1 對小鼠體質(zhì)量的影響 灌胃期間，各組的小鼠精神狀態(tài)良好，未見異常反應(yīng)，不同組藥物對小鼠體質(zhì)量的影響見表3。由表3可以看出，隨著飼養(yǎng)天數(shù)的增加，小鼠體質(zhì)量穩(wěn)速增長，增長情況略有差異，但實驗期間，各組小鼠體質(zhì)量增長趨勢相同。各給藥組與對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05），表明實驗所采用的藥物不影響小鼠的正常生長。

表3 不同組藥物對小鼠體質(zhì)量的影響（x0±s，n=40）Table 3 Effects of different drugs on body weight of mice（x0±s，n=40）

2.2.2 對小鼠力竭游泳時間的影響 運動耐力的下降是疲勞最直接和客觀的一種表現(xiàn)，在保健品評價方法中，力竭游泳時間是反映疲勞程度的一個重要指標(biāo)。由圖1可以看出，與空白對照組相比，給藥組小鼠游泳時間顯著延長，給藥組小鼠的游泳時間與空白組相比增加超過100%，都具有很高的抗疲勞活性。配方二組與配方三組優(yōu)于紅景天單方組，其中配方三組的游泳時間最長，而配方一組的游泳時間略低于單方組。

圖1 不同組藥物對小鼠力竭游泳時間的影響Fig.1 Effects of different drugs on exhaustive swimming time in mice

2.2.3 對運動小鼠血乳酸（LA）濃度和血清尿素氮（BUN）濃度的影響 通過測定小鼠運動后血乳酸的水平，可以了解其乳酸代謝情況，機體中乳酸的濃度與其疲勞程度密切正相關(guān)。由表4可知，小鼠游泳后，血LA濃度大幅度升高。與運動對照組相比，各給藥組均明顯降低LA濃度（p＜0.05），其中配方三組差異極顯著（p＜0.01）；配方一組和二組的LA水平也顯著低于紅景天單方組（p＜0.05）。同時，運動后小鼠血清BUN大幅度提高，給藥組均能顯著降低BUN濃度，其中配方一組與紅景天單方組基本相當(dāng)，配方三組降低BUN幅度最大，表現(xiàn)出良好的清除運動小鼠代謝產(chǎn)物的能力。

2.2.4 對運動小鼠肝糖元質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 運動耐力的強弱與機體糖元的儲備量有著密切的聯(lián)系，機體的糖元儲備和血糖水平直接影響運動耐力水平。由表5看出，游泳后小鼠體內(nèi)的肝糖元含量急速下降，給藥后，與運動對照組相比，有所增加。其中，配方一組與紅景天單方組效果基本相當(dāng)，對運動小鼠的肝糖元增加較少；配方二組和三組相比運動對照組提升顯著。文獻報道大量運動后肝臟組織損害嚴(yán)重，影響細(xì)胞的正常代謝和肝糖元合成。添加適量的肉蓯蓉可通過降低乳酸脫氫酶LDH 5的活性以及上調(diào)一氧化氮合酶NOS 3的表達來保護肝臟和促進乳酸的糖異生過程，從而促進體能恢復(fù)[25]。適當(dāng)增加具有補血活血功能的當(dāng)歸用量，能改善血液循環(huán)，提高運輸氧及各種原料的能力，加速糖元合成，有利于維持機體處于正常生理代謝水平。

2.3 復(fù)方紅景天對運動小鼠能量代謝相關(guān)酶活的影響

疲勞的產(chǎn)生及其緩解與運動時的能量供給密切相關(guān)。線粒體被稱為細(xì)胞內(nèi)的 “能量工廠”，SDH是反映線粒體功能的標(biāo)志酶之一，其活性一般可作為評價三羧酸循環(huán)運行程度的指標(biāo)。ATP酶是一類能將三磷酸腺苷催化水解為二磷酸腺苷和磷酸根離子的酶，釋放的能量可以通過傳遞而被用于驅(qū)動另一需要能量的反應(yīng)。CK催化三磷酸腺苷和肌酸，生成磷酸肌酸，是一個與細(xì)胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶。本節(jié)研究了不同藥物組對SDH、CK、ATP酶活性的影響，以進一步考察對運動小鼠能量代謝的干預(yù)作用，初步探討抗疲勞機制。

2.3.1 對運動小鼠SDH活力的影響 由表6可以看出，小鼠運動后SDH活性具有明顯組織特異性。與安靜對照組相比，游泳小鼠肝組織SDH顯著降低，給藥后有所升高，其中配方二組和配方三組的小鼠肝SDH含量較高，已接近安靜組水平；而小鼠骨骼肌SDH在運動后活性有所升高，給藥后小鼠SDH活力較安靜組有所升高，但低于運動對照組，其中配方三與運動對照組無顯著性差異。提高SDH活力，有利于有氧代謝過程的順暢進行，促進運動過程中能量的供給。

表6 不同組藥物對游泳小鼠SDH活力的影響Table 6 Effects of different groups of drugs on SDH activities after swimming in mice（x0±s，n=8）

2.3.2 對運動小鼠體內(nèi)CK活力的影響 在一定程度上，血清CK水平的高低與橫紋肌損害程度有關(guān)，肌細(xì)胞受損后，CK會經(jīng)細(xì)胞間隙滲透到淋巴液，最終進入血液循環(huán)，間接引起血清CK增加。由表7可以看出，與安靜組相比，游泳小鼠體內(nèi)骨骼肌和血清中的CK活力均有升高趨勢，這是因為正常狀態(tài)下，CK處于肌肉中，它的功能是使肌酸上増加磷酸基團，轉(zhuǎn)化為高能分子磷酸肌酸，釋放能量。當(dāng)肌肉損傷時，CK不能正常發(fā)揮功能，CK由肌肉細(xì)胞進入血液，在血液中檢測到CK含量增加，暗示肌肉損傷發(fā)生[26]。給藥組與運動對照組相比，血清CK活力均有所下降，其中配方三組降低顯著（p＜0.05），基本接近正常水平，表明紅景天復(fù)配各味中藥材大大降低了運動后細(xì)胞膜的損傷程度。而對于骨骼肌CK活力，運動組和給藥組與安靜組相比，均有所升高，其中只有配方三組與運動對照組有顯著性差異（p＜0.05）。

表7 各組藥物對小鼠血清和骨骼肌CK活力的影響Table 7 Effects of different groups of drugs on CK activities in serum and skeletal muscle in mice after swimming（x0±s，n=8）

2.3.3 對運動小鼠骨骼肌ATP酶活力的影響ATP酶活性高低可以反映機體能量代謝的水平。由表8可以看出，相比較安靜組，運動組小鼠骨骼肌中的Na+K+-ATP酶活和Ca2+Mg2+-ATP酶活均顯著降低，給藥后，酶活均有所升高，其中配方三組對Na+K+-ATP酶活的提高極顯著（p＜0.01），接近正常水平，配方二組也較顯著（p＜0.05），而配方一組和紅景天單方組提高Na+K+-ATP酶活的能力無統(tǒng)計學(xué)差異，都低于配方二組和配方三組。對于Ca2+Mg2+-ATP酶活，相比較運動對照組，各給藥組中只有配方三組提升顯著（p＜0.05），其他組增加不明顯。

表8 不同組藥物對游泳小鼠骨骼肌ATP酶活影響Table 8 Effects of different groups of drugs on ATPase activity of skeletal muscle after swimming in mice（x0±s，n=8）

3 結(jié)語

1）確定了復(fù)方紅景天抗疲勞藥物中的各藥材的提取工藝，并通過其中代表性物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析了各提取物中活性物質(zhì)五味子醇甲、枸杞多糖、黃精多糖、松果菊苷、阿魏酸的含量。

2）以兼補氣血、輔以補腎陽思路，保持中藥原藥總量4.0 g，確定了三組復(fù)方的組方。通過小鼠游泳實驗，以及血清BUN、血LA、肝糖元的測定，分析比較了各組方和單方紅景天的抗疲勞活性。結(jié)果表明各配方組均能提高運動小鼠的抗疲勞效果，配方二組和三組的活性優(yōu)于一組和單獨紅景天組，綜合比較，配方三組的活性更佳。

3）通過對運動小鼠體內(nèi)SDH、CK、ATP酶活的測定，進一步分析了各組方的抗疲勞活性，并從能量代謝方面對抗疲勞機制進行了初探。