蛋氨酸限制對(duì)高脂飲食小鼠骨骼的改善作用

郭海濤，王雅楠，張佳紅，施用暉，樂國(guó)偉*，2

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122）

隨著人們膳食中糖、脂能量所占的比例不斷增高，肥胖與其并發(fā)癥的發(fā)病率在逐年升高[1-3]。研究表明，超重和肥胖是引起骨質(zhì)疏松甚至骨折的重要因素之一[4]，高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠體重的增加與骨質(zhì)含量和骨密度之間呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)[5]。如何防治肥胖與骨質(zhì)疏松已成為重要的健康問題。

近些年來(lái)研究證實(shí)，蛋氨酸限制（Methionine restriction，MR）飲食是一種有效降低高脂飲食體重的方法[6]。但MR對(duì)大鼠和小鼠骨骼的作用，存在體重自身變化與骨代謝的雙重作用[7]。Ables等[7-8]經(jīng)14周研究發(fā)現(xiàn)MR提高高脂飲食小鼠FGF21的表達(dá)，促進(jìn)Pparγ的作用，增加膠原蛋白降解，使骨礦物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù) （Bone mineral content，BMC）和骨密度（Bone mineral density，BMD）顯著降低。而Huang等[9]的研究指出短期MR飲食能顯著降低大鼠骨量、股骨外在骨強(qiáng)度，但股骨的內(nèi)在骨強(qiáng)度卻顯著提高。MR飲食小鼠的BMC和BMD絕對(duì)量顯著降低，但經(jīng)過(guò)體質(zhì)量校正的小鼠骨骼參數(shù)是正常的[7]。MR飲食對(duì)小鼠骨骼生長(zhǎng)發(fā)育狀況的影響還存在爭(zhēng)論。肥胖時(shí)增加骨骼的負(fù)荷，一定程度刺激骨骼增長(zhǎng)，甚至出現(xiàn)局部的骨質(zhì)增生。因此，MR飲食對(duì)骨骼的作用不僅限于BMC和BMD等指標(biāo)，需要進(jìn)一步觀察MR飲食對(duì)骨骼組織的微結(jié)構(gòu)以及生物力學(xué)參數(shù)的影響，此外，MR作為肥胖干預(yù)的膳食，有必要觀察MR飲食的時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)骨骼的影響及其變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC） 測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；氧化型谷胱甘肽（GSSG）和還原型谷胱甘肽（GSH）標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；其余試劑均為分析純：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-4-10型箱式電阻爐控制箱：天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)：安泰公司產(chǎn)品；SpectraMax M5/M5e酶標(biāo)儀：美國(guó)Molecular Devices公司產(chǎn)品；5804R冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；XB70制冰機(jī)：美國(guó)GRANT公司產(chǎn)品；μCT80 MicroCT：SCANCO 產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 4周齡清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠54只，初始體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自于南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院。適應(yīng)性飼喂1周后，隨機(jī)分成3組：對(duì)照組 （4%脂肪+0.86%蛋氨酸，CON）；高脂組（20%脂肪+0.86%蛋氨酸，HF）；高脂蛋氨酸限制組（20%脂肪+0.17%蛋氨酸，MR）。

所有小鼠在同室分籠飼養(yǎng)，溫度（23±2）℃，濕度60%，給予12 h/12 h晝夜循環(huán)光照。小鼠自由采食飲水，每周稱取一次體重。飼喂11周、22周后分別對(duì)各組小鼠禁食12 h，氟烷麻醉后處死，取股骨樣品。

1.3.2 組織樣品制備 在冰浴上操作，迅速取出股骨，去除股骨上多余附著肌腱組織；左腿股骨分成兩段，近心端一段用預(yù)冷生理鹽水制備成10%組織勻漿液，并置于-20℃?zhèn)溆?，用試劑盒測(cè)定股骨的T-AOC、MDA和GSH/GSSG。22周小鼠股骨遠(yuǎn)心端一段用于顯微CT（Micro-CT）掃描檢測(cè)，測(cè)定骨體積分?jǐn)?shù)（Bone volume fraction，BV/TV）、骨礦物質(zhì)密度（BMD）、 結(jié)構(gòu)模型指數(shù) （Structure model index，SMI）、骨小梁數(shù)量（Trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（Trabecular thickness，Tb.Th）和骨小梁分離度（Trabecular separation，Tb.Sp）。 將 9 只小鼠右腿的股骨取出用游標(biāo)卡尺測(cè)量股骨長(zhǎng)度，然后用于三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)得到股骨最大荷載值即骨強(qiáng)度，三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)后收集斷裂的右腿股骨，將股骨放入烘箱烘干至恒重，測(cè)量骨干重；然后將股骨放入坩堝中，碳化至無(wú)煙，放入550℃馬弗爐中灰化12 h，恒重，測(cè)定灰分重量（BMC）。將另外9只小鼠的右腿股骨放入中性福爾馬林中進(jìn)行固定，脫鈣后，進(jìn)行HE染色切片，觀察切片中脂肪細(xì)胞和骨小梁的生長(zhǎng)情況。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，用ANOVA進(jìn)行多重比較和方差分析，結(jié)果采用±s表示，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠體重和股骨的基礎(chǔ)指標(biāo)變化

實(shí)驗(yàn)22周后，與CON組相比，HF組小鼠的體重顯著性升高 （P<0.05）；MR組小鼠的體重顯著低于HF組（P<0.05），與對(duì)照組一致，表明MR飲食控制了小鼠體重的增長(zhǎng)。11周后，MR組小鼠的股骨長(zhǎng)度、骨干重、骨礦物質(zhì)含量顯著低于HF組 （P<0.05）；22周后，與CON組相比，HF組股骨干重、長(zhǎng)度與BMC沒有顯著差異（P>0.05）；與HF組相比，MR組股骨干重和長(zhǎng)度沒有顯著差異 （P>0.05），而BMC 顯著增加（P<0.05）（表 1）。 綜上，11周 MR 飲食，小鼠股骨長(zhǎng)度、骨干重、骨礦物質(zhì)顯著降低，與Ables等[8]研究結(jié)果一致。但22周后，MR飲食控制了小鼠肥胖，而且提高了小鼠股骨干重和礦物質(zhì)沉積，股骨長(zhǎng)度與對(duì)照組接近。

表1 不同時(shí)期MR對(duì)高脂小鼠體質(zhì)量，股骨長(zhǎng)度，股骨干重和BMC的影響Table 1 Effect of MR on body mass，femur length，femur dry weight and BMC of HFD fed mice in different periods

2.2 股骨生物力學(xué)指標(biāo)

股骨進(jìn)行的三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果顯示，與CON組和MR組相比，HF組小鼠11周、22周后股骨強(qiáng)度顯著升高（P<0.05），經(jīng)過(guò)體重校正以后，股骨強(qiáng)度/體重顯著降低（P>0.05）；MR 組 11周、22 周后骨強(qiáng)度及小鼠體重校正以后的股骨強(qiáng)度/體重均與對(duì)照組接近，而股骨強(qiáng)度/體重顯著高于 （P<0.05）HF組（見表2）。HF組小鼠骨強(qiáng)度的增加是適應(yīng)其體重增加的代償性提高，經(jīng)過(guò)體重校正以后，單位骨強(qiáng)度反而降低。與低脂肪飲食相比，大部分“西方化”飲食中糖和脂肪的含量很高，長(zhǎng)期食用這種飲食會(huì)使體重增加，機(jī)體氧化應(yīng)激水平也急劇增高[10]。在肥胖兒童體內(nèi)，雖然肌肉總量較高，但是相比于同齡不肥胖的兒童來(lái)說(shuō)，肥胖兒童表現(xiàn)出更高的骨折率[11]，表明肥胖對(duì)于骨骼的發(fā)育是不利的。無(wú)論短期還是長(zhǎng)期MR飲食干預(yù)都會(huì)降低股骨強(qiáng)度，但這些降低是相對(duì)的，單位骨強(qiáng)度并不會(huì)降低。骨強(qiáng)度并不能完全代表骨骼的生長(zhǎng)情況，骨折的發(fā)生也不是完全由骨強(qiáng)度決定的，想弄清楚骨骼的生長(zhǎng)，需要與其他骨骼指標(biāo)共同說(shuō)明。MR組股骨中礦物質(zhì)含量、骨組織體積和骨小梁厚度的增加，可能是MR組單位骨強(qiáng)度提高的主要原因。

表2 不同時(shí)期MR對(duì)高脂小鼠股骨生物力學(xué)的影響Table 2 Effects of MR on femur biomechanical peoperties of HFD fed mice in different periods

2.3 股骨遠(yuǎn)心端松質(zhì)骨Micro-CT定量參數(shù)的變化

對(duì)22周實(shí)驗(yàn)小鼠遠(yuǎn)心端股骨進(jìn)行3D顯微CT的結(jié)果顯示，與CON組相比，HF組Tb.Th和BV/TV顯著降低 （P<0.05），Tb.Sp，SMI，Tb.N 和 BMD 均沒有顯著差異（P>0.05）；與HF組相比，MR組的Tb.Th和 BV/TV 均顯著增加 （P<0.05），Tb.Sp，SMI，Tb.N，BMD 沒有顯著差異（P>0.05）（表 3）。結(jié)果表明，長(zhǎng)期的MR飲食增加了骨小梁的形成速度和厚度，股骨中骨鹽沉積增多，有利于骨骼生長(zhǎng)。而本研究結(jié)果證明在小鼠體成熟以后繼續(xù)飼喂MR飲食一段時(shí)間，骨鹽積累會(huì)增加，BMC升高，體現(xiàn)了長(zhǎng)期MR飲食可能轉(zhuǎn)變了短期MR飲食對(duì)小鼠骨骼的部分不利影響。

表3 MR對(duì)高脂小鼠股骨遠(yuǎn)心端松質(zhì)骨Micro-CT定量參數(shù)的影響Table 3 Microcomputed tomography（μCT）derived cancellous bone parameters at the distal femur in MR mice

2.4 股骨氧化應(yīng)激水平

與CON組相比，HF組小鼠股骨MDA顯著增加（P<0.05），T-AOC 顯著降低（P<0.05），GSH/GSSG無(wú)顯著差異（P>0.05）；與HF組相比，MR組小鼠股骨MDA顯著降低 （P<0.05），T-AOC顯著升高 （P<0.05），GSH/GSSG 無(wú)顯著差異（P>0.05）。以上結(jié)果表明，高脂飲食會(huì)造成骨組織的氧化應(yīng)激，HF組表現(xiàn)出抗氧化能力降低，脂質(zhì)過(guò)氧化，而MR飲食使股骨MDA含量顯著降低，T-AOC含量顯著上升，對(duì)高脂飲食引起的機(jī)體氧化應(yīng)激有很大的改善作用。氧化應(yīng)激是骨質(zhì)疏松的重要病因[12-13]，MR飲食對(duì)骨骼氧化應(yīng)激的改善作用可能是MR飲食改善骨性能的重要原因之一[14-15]（表 4）。

表4 不同時(shí)期MR對(duì)HFD小鼠股骨氧化還原指標(biāo)的影響Table 4 Effect of MR on femur oxidant stress biomarkers of HFD fed mice in different periods

2.5 股骨HE染色切片

圖1是小鼠股骨遠(yuǎn)心端HE染色切片，在放大40倍情況下，與CON組相比，HF組骨小梁差異不明顯，但脂肪空泡較多；MR組與HF組相比，骨小梁厚度較大，骨小梁數(shù)量差別不明顯，空泡顯著減少，與對(duì)照組相近。表明MR飲食可顯著減少骨骼中脂肪細(xì)胞積累。從小鼠股骨遠(yuǎn)心端Micro-CT掃描結(jié)果也可看出，與CON組相比，HF組小鼠骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)松散，骨小梁變薄；而MR組較HF組，骨小梁更加緊密，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)排列密集，骨小梁有增厚跡象。

骨骼中脂肪細(xì)胞增多是骨量丟失的原因之一[16]。本研究通過(guò)對(duì)遠(yuǎn)心端股骨進(jìn)行HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，高脂飲食刺激了骨脂肪細(xì)胞的生成，同時(shí)降低松質(zhì)骨體積。可能的原因是高脂飲食可以增加骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）向脂肪細(xì)胞分化的能力，而降低其向成骨細(xì)胞分化的能力[17]，而MR飲食顯著減少了骨組織中的脂肪空泡，松質(zhì)骨體積上升，表明長(zhǎng)期MR飲食可能與MSC向成骨細(xì)胞分化的能力上升或使其向脂肪細(xì)胞分化的能力降低。

長(zhǎng)期和短期MR飲食對(duì)骨骼造成不同影響的原因還可能是，小鼠處于體重快速增長(zhǎng)期時(shí)需要的營(yíng)養(yǎng)元素較多，蛋氨酸需求量也較多，此時(shí)若限制飲食中蛋氨酸含量可降低小鼠體重和骨骼的生長(zhǎng)速度。小鼠處在體重增長(zhǎng)平穩(wěn)期時(shí)需要的蛋氨酸含量降低，此時(shí)繼續(xù)進(jìn)行MR飲食干預(yù)可降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平，增加骨礦含量、骨組織體積和骨小梁厚度，提高骨性能。

3 結(jié) 語(yǔ)

長(zhǎng)期MR飲食干預(yù)限制了小鼠體重的增長(zhǎng)與肥胖，股骨中礦物質(zhì)含量增加、骨小梁增厚、骨組織增大、松質(zhì)骨網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加緊密，顯著提高了單位骨強(qiáng)度，骨骼性能得到改善。造成這些的原因可能是長(zhǎng)期MR飲食降低小鼠骨骼氧化應(yīng)激，股骨中脂肪細(xì)胞的含量降低。長(zhǎng)期與短期MR飲食對(duì)骨骼造成的不同影響，可能是由于小鼠處于不同的體重增長(zhǎng)期，11周尚處于生長(zhǎng)期，MR可能影響骨骼生長(zhǎng)與代謝，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

圖1 MR對(duì)高脂小鼠股骨遠(yuǎn)心端松質(zhì)骨顯微結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 HE staining of mice distal femur in different groups