食品級(jí)刺五加葉黃酮微乳的制備及功能特性

于鑫欣，趙多佳，張 釙，孫廣梅，徐曉娟，張英華*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

近年來(lái)隨著人們對(duì)功能性食品需求的提升，生物類(lèi)黃酮開(kāi)始被廣泛用作膳食補(bǔ)充劑。刺五加中的黃酮類(lèi)物質(zhì)具有廣泛的藥理活性，除對(duì)人體具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射及抗疲勞作用外，還可治療心腦血管疾病、糖尿病、神經(jīng)衰弱等癥[1]。大量實(shí)驗(yàn)表明，黃酮類(lèi)物質(zhì)在抗氧化反應(yīng)中不僅能阻抑自由基鏈反應(yīng)的引發(fā)，而且可以直接捕獲自由基反應(yīng)鏈中的自由基，阻斷自由基鏈反應(yīng)，起到預(yù)防和斷鏈的雙重作用，是優(yōu)良的天然抗氧化劑，有較強(qiáng)的清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和超氧陰離子自由基（O2-·）的能力，并能夠有效抑制油脂氧化[2-5]。同時(shí)，黃酮化合物具有廣譜抑菌性能[6-8]。刺五加中的各個(gè)部分均含有黃酮類(lèi)化合物，葉中含量最多。陳貌連等利用電噴霧質(zhì)譜從刺五加葉中檢測(cè)到4 種黃酮類(lèi)化合物，除金絲桃苷外，其余3 種為首次在刺五加葉中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)測(cè)定，槲皮素及相關(guān)黃酮類(lèi)化合物在刺五加葉中的含量高達(dá)37.25%[9]。但黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶解度和生物利用度低，同時(shí)黃酮類(lèi)物質(zhì)含有多個(gè)羥基，耐堿性和抗光解能力差，化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，從而限制了其在食品中的應(yīng)用[10]。因此，尋求合適的手段進(jìn)一步改善黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶解性、提高其穩(wěn)定性和生物利用度十分必要。

微乳液具有黏度小、熱力學(xué)穩(wěn)定等特點(diǎn)，是難溶性物質(zhì)的良好載體，可解決某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)因難溶、易氧化等缺點(diǎn)而造成的難以利用的問(wèn)題[11-13]?；谖⑷榈氖称份d體研究迅速地發(fā)展起來(lái)[14-15]。國(guó)內(nèi)外對(duì)于微乳的報(bào)道近幾年也逐漸增多，郭瑞雪以微乳區(qū)域面積為指標(biāo)，利用偽三元相圖對(duì)微乳的處方進(jìn)行優(yōu)化，確定楊梅素微乳的最佳配方，并研究其穩(wěn)定性[16]；Sharma等制備二甲胺基硼烷/丙二醇/三乙酰甘油酯/胰島素水溶液微乳并對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行研究，結(jié)果表明其生物利用度為空白胰島素溶液的10 倍，同時(shí)其通過(guò)透射電子顯微鏡、熒光光譜儀對(duì)微乳性質(zhì)進(jìn)行了研究[17]。微乳用于食品中可以解決某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)難溶、不易吸收、易氧化等缺點(diǎn)，掩蓋不良的氣味，并防止食品在加工與保藏過(guò)程中發(fā)生質(zhì)量劣變，還可以對(duì)活性成分進(jìn)行可控釋放[18]。將黃酮類(lèi)化合物用微乳包埋以后可以有效解決刺五加葉黃酮化合物的溶解性低、穩(wěn)定性差等問(wèn)題，有效提高其生物利用度。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于食品級(jí)微乳的報(bào)道相對(duì)較少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)選擇食品級(jí)的表面活性劑、助表面活性劑以及食用油制備食品級(jí)O/W型刺五加葉黃酮微乳，以期減少表面活性劑和助表面活性劑的添加比例，增加安全性并提高黃酮化合物的化學(xué)穩(wěn)定性，保護(hù)其生物活性。刺五加葉黃酮微乳制劑的開(kāi)發(fā)在食品、保健品和藥品領(lǐng)域中具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)使用的致病性大腸桿菌（簡(jiǎn)稱(chēng)大腸桿菌）、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和熒光假單胞菌均購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

刺五加葉為市售；肉豆蔻酸異丙酯、聚氧乙烯蓖麻油上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；Tween 20、Tween 60、Tween-80、油酸乙酯 上海晶純?cè)噭┯邢薰?；食品?jí)橄欖油 益海嘉里集團(tuán)；丁酸乙酯 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；1,2-丙二醇、丙三醇、正丁醇、異丙醇、無(wú)水乙醇 天津市博迪化工有限公司；牛肉膏、蛋白胨北京奧博星生物技術(shù)有限公司；抗壞血酸 天津市天力化學(xué)試劑有限公司。其他分析試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

H-7650透射電子顯微鏡 日本日立公司；Zetasizer3000HSA型激光粒度分布儀 英國(guó)Malvern公司；TU-1800紫外-可見(jiàn)分光光度儀 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TCL-16C臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；無(wú)菌超凈臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；DH5000A電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特儀器有限公司；烏氏黏度計(jì)（毛細(xì)管內(nèi)徑0.46 mm） 上海隆拓儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 食品級(jí)微乳偽三元相圖的繪制

將表面活性劑和助表面活性劑按一定質(zhì)量比（Km，分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）混合，再按一定質(zhì)量比（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1）與橄欖油混合均勻，加入帶有磁力攪拌子的稱(chēng)量瓶中，稱(chēng)其質(zhì)量并控制其總質(zhì)量一定。將稱(chēng)量瓶恒溫（25±1）℃后，在不斷攪拌下用細(xì)滴管小心滴加雙蒸水，同時(shí)觀(guān)察瓶中溶液狀態(tài)的變化，直至澄清透明的微乳形成，繼續(xù)滴定，觀(guān)察可能發(fā)生的變化，以確定微乳區(qū)界限。在滴加過(guò)程中，當(dāng)乳液黏度較大時(shí)，用偏光顯微鏡觀(guān)察有無(wú)雙折射現(xiàn)象，發(fā)亮的為液晶，不發(fā)亮的為凝膠，同時(shí)記錄乳液外觀(guān)由澄清變?yōu)闇啙峄蛴蓽啙嶙優(yōu)槌吻鍟r(shí)各組分的臨界加入量。采用4 組分偽三元相圖，以表面活性劑和助表面活性劑作為三元相圖的一個(gè)頂點(diǎn)（S），油相和水相分別為三元相圖的另兩個(gè)頂點(diǎn)（O、W），根據(jù)油、水、表面活性劑在臨界點(diǎn)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來(lái)確定該點(diǎn)在相圖中的位置，將每個(gè)臨界點(diǎn)連成曲線(xiàn)即得該組分在一定Km下的偽三元相圖，確定微乳區(qū)，比較各相圖的微乳區(qū)面積，對(duì)配方進(jìn)行初步篩選[19]。

1.3.2 食品級(jí)空白微乳的制備

按照1.3.1節(jié)的操作繪制偽三元相圖，研究表面活性劑、助表面活性劑、表面活性劑與助表面活性劑的質(zhì)量比（Km）、油相4 個(gè)因素對(duì)食品級(jí)微乳形成的影響。

根據(jù)相圖篩選出表1中的兩個(gè)配方，按照配方比例應(yīng)用滴加水相法制備空白微乳。

表1 微乳配方中各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Compositions of different microemulsions%

1.3.3 食品級(jí)刺五加葉黃酮微乳的制備

先將黃酮類(lèi)物質(zhì)溶于油相中，取刺五加葉黃酮化合物置于燒杯中，分別加入20 mL的A、B空白微乳溶液，25 ℃、200 r/min在磁力攪拌器上連續(xù)分散12 h，使其達(dá)飽和狀態(tài)，靜置2 h以達(dá)到平衡。用0.8 μm的濾膜過(guò)濾即可得到刺五加葉黃酮微乳A’、B’[20]。

1.3.4 食品級(jí)微乳理化性質(zhì)的測(cè)定和穩(wěn)定性考察

1.3.4.1 微乳的形態(tài)觀(guān)察

采用透射電子顯微鏡對(duì)微乳進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)。選取制備好的微乳，用去離子水稀釋100 倍體積，取一滴稀釋液將其滴在覆有支持膜的銅網(wǎng)上，靜置10 min后，再滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上復(fù)染5 min，自然揮發(fā)干，透射電子顯微鏡觀(guān)察、拍照[21]。

1.3.4.2 微乳的粒徑測(cè)定

在比色杯中加入適量的待測(cè)微乳樣品，使用Zetasizer 3000HSA光散射測(cè)徑儀測(cè)定樣品的粒徑及分布。儀器參數(shù)設(shè)定如下：溫度設(shè)定為25 ℃，散射角度設(shè)定為90°[22]。

1.3.4.3 微乳黏度的測(cè)定

用烏氏黏度計(jì)，依照黏度測(cè)定法第一法（《中華人民共和國(guó)藥典》2005版附錄VI G）恒溫20 ℃條件下測(cè)定。

1.3.4.4 微乳的類(lèi)型判斷

取相同體積的微乳兩份，分別同時(shí)加入蘇丹紅III染料和亞甲基藍(lán)染料溶液2 滴，靜置觀(guān)察兩種染料（紅色和藍(lán)色）在微乳中的擴(kuò)散速率以及外觀(guān)的變化。微乳類(lèi)型判定標(biāo)準(zhǔn)為：如藍(lán)色的擴(kuò)散速率大于紅色，則為水包油（O/W）型微乳；反之為油包水（W/O）型微乳；二者速率相同，則為雙連續(xù)型微乳[23]。

1.3.4.5 微乳穩(wěn)定性的測(cè)定

分別考察微乳高速離心、不同溫度下長(zhǎng)時(shí)間放置對(duì)微乳穩(wěn)定性的影響，以微乳的顏色和狀態(tài)評(píng)定微乳是否穩(wěn)定。

1.3.5 刺五加葉中黃酮類(lèi)化合物的提取

以刺五加葉為原料，采用乙醇回流方式提取葉中的黃酮類(lèi)化合物。參照文獻(xiàn)[24-25]方法進(jìn)行提取。

1.3.6 抗氧化能力的測(cè)定

1.3.6.1 清除O2-·能力測(cè)定

在10 mL試管中加入4.5 mL pH 8.2磷酸鹽緩沖液，25 ℃水浴20 min，分別加入1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液和25 ℃預(yù)熱的0.4 mL 25 mol/L鄰苯三酚溶液，振蕩3 min后立即加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%抗壞血酸，振蕩均勻。在320 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[26]。按式（1）計(jì)算O2-·清除率。

式中：A0為不加樣品時(shí)吸光度；Al為加入樣品的吸光度；A2為不加鄰苯三酚樣品的吸光度。

1.3.6.2 清除羥自由基能力測(cè)定

利用Fenton反應(yīng)檢測(cè)黃酮及黃酮微乳對(duì)羥自由基（·OH）的清除作用[27]。·OH清除率按式（2）計(jì)算。

式中：A對(duì)照為以等體積的重蒸水代替樣品溶液和H2O2溶液的吸光度；A空白為以等體積的重蒸水代替樣品溶液的吸光度；A樣品為樣品溶液的吸光度。

1.3.6.3 清除DPPH自由基能力測(cè)定

在10 mL試管中分別加入各質(zhì)量濃度樣品液2 mL及2×10-4mol/L DPPH溶液2 mL，搖勻，30 min后在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度Ai，同時(shí)測(cè)定2 mL 2×10-4mol/L DPPH溶液與2 mL無(wú)水乙醇混合液的吸光度Ac，以及2 mL測(cè)定液與2 mL無(wú)水乙醇混合液的吸光度Aj，根據(jù)式（3）計(jì)算樣品液對(duì)DPPH自由基的清除率[28]。

1.3.7 抑菌圈實(shí)驗(yàn)

5 種不同質(zhì)量濃度的刺五加葉黃酮溶液和黃酮微乳中分別放入直徑為6 mm的滅菌濾紙片，浸泡12 h，待其自然干燥后，用紫外線(xiàn)照射滅菌10～15 min，之后將濾紙片放在含供試菌（0.1 mL濃度為105～106CFU/mL的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌及熒光假單胞菌）的平板上，把每個(gè)處理過(guò)的培養(yǎng)皿放到各供試菌最適溫度下培養(yǎng)48 h。用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑，以生理鹽水作空白對(duì)照，各供試菌做3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)[29]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 8.0軟件繪制偽三元相圖，用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。與對(duì)照組比較，當(dāng)P＜0.01時(shí)表示具有極顯著性差異，P＜0.05時(shí)表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 食品級(jí)微乳形成的影響因素

本研究的目的是制備乳化劑含量低、質(zhì)量指標(biāo)良好的微乳，故選擇與乳化劑含量、粒徑和微乳穩(wěn)定性關(guān)系密切的微乳區(qū)面積作為主要的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2.1.1 油相的選擇

圖1 不同油相對(duì)偽三元相圖的影響Fig. 1 Pseudo-ternary phase diagrams with different oil phases

在25 ℃和Km＝2條件下，以乙醇為助表面活性劑和Tween-80為表面活性劑分別與不同油相制備微乳，所形成的微乳區(qū)域如圖1所示。肉豆蔻酸異丙酯的微乳區(qū)域面積最大，油酸乙酯其次，而橄欖油、玉米油和豆油作為油相的體系均不能形成微乳，可能是因?yàn)檫@幾種油相都是混合物，純度不高。刺五加葉黃酮化合物在各油相中的溶解度順序?yàn)椋喝舛罐⑺岙惐ィ居退嵋阴ィ居退幔径∷嵋阴ィ鹃蠙煊停敬蠖褂?，綜合考慮刺五加葉黃酮在各油相中的飽和溶解度，選用肉豆蔻酸異丙酯為油相。

2.1.2 助表面活性劑的選擇

在25 ℃和Km＝2條件下，固定Tween-80為表面活性劑、丁酸乙酯為油相，用偽三元相圖從乙醇、丙三醇、1,2-丙二醇、聚乙二醇、正丁醇、異丙醇中篩選出形成微乳區(qū)域面積最大的助表面活性劑。由圖2可知，乙醇形成的微乳區(qū)域面積最大，其次是異丙醇和1,2-丙二醇，甘油由于黏度最大，易形成凝膠和液晶，導(dǎo)致形成微乳區(qū)域面積最小。所以選擇乙醇為最佳的助表面活性劑。

圖2 不同助表面活性劑對(duì)偽三元相圖的影響Fig. 2 Pseudo-ternary phase diagrams with different cosurfactants

2.1.3 表面活性劑的選擇

在25 ℃和Km＝2條件下，以肉豆蔻酸異丙酯為油相和乙醇為助表面活性劑分別與不同的表面活性劑制備微乳，所形成的微乳區(qū)域見(jiàn)圖3。不難看出Tween-80/乙醇/肉豆蔻酸異丙酯形成的微乳區(qū)域面積最大，效果最佳，微乳可無(wú)限稀釋。所以選擇微乳區(qū)域面積較大的Tween-80作表面活性劑。

圖3 不同表面活性劑對(duì)偽三元相圖的影響Fig. 3 Pseudo-ternary phase diagrams with different surfactants

2.1.4 表面活性劑/助表面活性劑Km的選擇

在25 ℃條件下，以乙醇為助表面活性劑、肉豆蔻酸異丙酯為油相、Tween-80為表面活性劑，分別以不同的Km制備微乳，所形成的微乳區(qū)域見(jiàn)圖4。在一定范圍內(nèi)隨著Km的增加，微乳區(qū)域面積也增加，當(dāng)Km為2時(shí)微乳區(qū)域面積達(dá)到最大，隨后Km過(guò)大易形成液晶和凝膠，導(dǎo)致微乳區(qū)面積減小，而且高濃度的表面活性劑會(huì)增大微乳的黏度，不利于其在實(shí)際領(lǐng)域中的一些應(yīng)用（如注射藥劑）。

圖4 不同Km對(duì)偽三元相圖的影響Fig. 4 Pseudo-ternary phase diagrams with different Km

2.1.5 刺五加葉黃酮提取物的添加對(duì)微乳區(qū)域的影響

在25 ℃、Km＝2條件下，以乙醇為助表面活性劑、Tween-80為表面活性劑、肉豆蔻酸異丙酯為油相，在此條件下制備微乳，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 刺五加葉黃酮對(duì)偽三元相圖的影響Fig. 5 Effect of flavonoids on pseudo-ternary phase diagram

從圖5中可以看出，空白微乳和刺五加葉黃酮微乳的區(qū)域面積變化不明顯，所以，刺五加葉黃酮的加入對(duì)微乳區(qū)域面積幾乎沒(méi)有影響。在Tween-80體系中，刺五加葉黃酮類(lèi)化合物的加入對(duì)微乳區(qū)域略有影響但很小，這可能是因?yàn)樗幬锓肿硬粌H分布于微乳液的油相和水相，而且可能與微乳的界面膜發(fā)生相互作用而均勻分散，因此不會(huì)影響微乳形成的區(qū)域范圍。

2.2 微乳理化性質(zhì)的測(cè)定和穩(wěn)定性考察

2.2.1 微乳的理化性質(zhì)

室溫下，空白微乳A、B外觀(guān)呈透明、淡黃色，黏度小、流動(dòng)性好的液體。刺五加葉黃酮微乳A’、B’的外觀(guān)呈黃綠色、透明、黏度小、流動(dòng)性高的液體。按照1.3.3.4節(jié)方法測(cè)定微乳類(lèi)型，亞甲基藍(lán)在微乳中的擴(kuò)散速率明顯快于蘇丹紅III，結(jié)果表明所制備的微乳為O/W型。

2.2.2 微乳的形態(tài)

透射電子顯微鏡下，空白微乳A及刺五加葉黃酮微乳B的液滴呈球形，粒徑比較均一（圖6）。

圖6 空白微乳及刺五加葉黃酮微乳的透射電子顯微鏡照片（100 000×）Fig. 6 TEM images of microemulsion with and without flavonoids (100 000 ×)

2.2.3 微乳的粒徑

所制備的微乳粒徑分布見(jiàn)圖7，空白微乳與黃酮微乳的粒徑均在10～100 nm范圍之間，符合微乳的要求，粒徑分布情況均為正態(tài)分布。

圖7 刺五加葉黃酮微乳與空白微乳的粒徑分布Fig. 7 Particle size distribution of microemulsion with and without flavonoids

2.2.4 微乳的黏度

經(jīng)測(cè)定空白微乳A、B的平均黏度分別為（4.17±0.08）mm2/s和（2.64±0.05）mm2/s，刺五加葉黃酮微乳A’、B’的平均黏度分別為（4.18±0.05）mm2/s和（2.63±0.03）mm2/s，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所制備的微乳黏度較小，流動(dòng)性指標(biāo)良好。微乳的流變性對(duì)微乳制劑的使用具有重要的意義，液體需要有一定的流動(dòng)性，如口服劑需易從容器中傾出，皮膚用藥需要有適宜的鋪展性等。

2.2.5 微乳的穩(wěn)定性

空白微乳和刺五加葉黃酮微乳分別經(jīng)4 000 r/min離心30 min、10 000 r/min離心20 min后，仍保持原有狀態(tài)，透明且不分層。

將配制好的空白微乳和刺五加葉黃酮微乳分別放置在4、25 ℃和37 ℃下，分別在5、10、20、40、60、90 d觀(guān)察其外觀(guān)，結(jié)果微乳均為透明、不分層、狀態(tài)穩(wěn)定。最佳配方制備的微乳在中、低溫下均穩(wěn)定，可以長(zhǎng)時(shí)間貯存，可作為食品與藥品的載體。

2.3 刺五加葉黃酮微乳抗氧化、抑菌能力分析

按照1.3.3節(jié)的實(shí)驗(yàn)方法，制備刺五加葉黃酮微乳A’，對(duì)其進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)并以相同質(zhì)量濃度的刺五加葉黃酮提取物作空白對(duì)照。

2.3.1 抗氧化能力分析結(jié)果

分析樣品的抗氧化能力，以各自由基清除率與黃酮質(zhì)量濃度作圖，結(jié)果見(jiàn)圖8。不同質(zhì)量濃度的刺五加葉黃酮類(lèi)化合物及刺五加葉黃酮微乳都有較好的清除O2—·、·OH、DPPH自由基能力，并隨著刺五加葉黃酮類(lèi)化合物質(zhì)量濃度的增加而不斷增強(qiáng)。相同質(zhì)量濃度的刺五加葉黃酮的抗氧化性不及黃酮微乳，表明微乳對(duì)刺五加葉黃酮提取物有一定的保護(hù)作用，能提高其抗氧化能力。微乳作為活性物質(zhì)的載體能夠保護(hù)活性物質(zhì)不被破壞，王錦旋采用自微乳化技術(shù)和膜控釋包衣技術(shù)制備了山楂葉總黃酮自微乳化膜控釋滴丸，并測(cè)定了其體外釋放度[30]；顏秀花等制備出了β-胡蘿卜素微乳液并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行了研究[31]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明微乳能夠保護(hù)生物活性物質(zhì)，與本實(shí)驗(yàn)中黃酮微乳清除O2—·、·OH、DPPH自由基的能力均優(yōu)于黃酮溶液的結(jié)果相同。

圖8 不同質(zhì)量濃度的刺五加葉黃酮和刺五加葉黃酮微乳溶液抗氧化能力的比較Fig. 8 Antioxidant capacity of flavonoids from Acanthopanax senticosus leaves at different concentrations and microemulsion with flavonoids

2.3.2 抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果

進(jìn)行抑菌圈實(shí)驗(yàn)，考察刺五加葉黃酮微乳液對(duì)各供試菌的抑菌能力，同時(shí)以刺五加葉黃酮溶液作空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同質(zhì)量濃度的刺五加葉黃酮和刺五加葉黃酮微乳下供試菌的抑菌圈直徑Table 2 Antibacterial effects of flavonoids at different concentrations and microemulsion with flavonoids on test bacteria mm

表2結(jié)果表明，刺五加葉黃酮及其微乳對(duì)供試菌均有較顯著的抑制作用，并且隨著刺五加葉黃酮提取物質(zhì)量濃度的增加，其抑菌效果明顯提高。酚類(lèi)化合物及其衍生物一般呈弱酸性，能使蛋白質(zhì)凝固或變性[32]。因而黃酮類(lèi)化合物作為植物多酚類(lèi)的衍生物，也表現(xiàn)出一定的抑菌作用。由表2可直觀(guān)地看出，刺五加葉黃酮微乳對(duì)供試菌的抑制作用均優(yōu)于刺五加葉黃酮對(duì)照，并且，隨著質(zhì)量濃度的升高，抑菌圈直徑增大，當(dāng)制備的黃酮微乳質(zhì)量濃度為8 g/L時(shí)，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌及熒光假單胞菌的抑菌圈直徑分別為20.36、19.41、18.03、15.63 mm。并且各質(zhì)量濃度刺五加葉黃酮微乳對(duì)供試菌的抑制作用差異顯著。刺五加葉黃酮微乳的抑菌效果優(yōu)于黃酮溶液的原因一方面是由于黃酮的生物活性在微乳液中得到保存；另一方面是微乳本身所具有的抑菌作用[33]。

3 討 論

微乳制備和處方篩選的經(jīng)典方法為偽三元相圖法，本實(shí)驗(yàn)利用偽三元相圖考察了不同組合的空白微乳成乳情況，結(jié)果表明，微乳的微乳區(qū)域受多方面因素的影響，必須綜合考察油相、表面活性劑、助表面活性劑、Km的作用。

制備微乳時(shí)油相分子的大小對(duì)微乳的形成較為重要，理論上油相分子體積越小，溶解力越強(qiáng)，越易形成微乳，原因在于大分子油相不易嵌入表面活性劑中。本實(shí)驗(yàn)中肉豆蔻酸異丙酯是小分子油相，碳鏈短、極性強(qiáng)，它在水相中有一定的溶解度，與親水性混合表面活性劑互相滲透的能力最強(qiáng)，比較容易滲透到油-水間混合表面活性劑形成的界面膜中，因而其微乳區(qū)最大[34]。

在油-水-表面活性劑體系中，油和水之間的界面張力已大幅降低，但仍不能形成微乳或極少能形成微乳。助表面活性劑的存在會(huì)產(chǎn)生混合吸附，導(dǎo)致界面張力進(jìn)一步下降[35]。此外，油-水界面的柔性對(duì)微乳的形成也很關(guān)鍵，當(dāng)體系中有助表面活性劑存在時(shí)，表面活性劑與其形成混合膜，增加界面的柔性，易于彎曲，更易形成微乳。由圖2可知，乙醇形成的微乳區(qū)面積最大，比較穩(wěn)定，且無(wú)限稀釋微乳仍能保持透明、澄清狀態(tài)。在表面活性劑的選擇上，親水親油平衡（hydrophile lipophilic balance，HLB）值與被乳化物（即油相）的HLB值相等時(shí)，其乳化效果最好[36]，對(duì)油相的增溶能力也就越強(qiáng)，即微乳區(qū)就越大。非離子表面活性劑由于其本身毒性和刺激性小，成為食品行業(yè)廣受關(guān)注的表面活性劑類(lèi)型。本實(shí)驗(yàn)選擇的非離子表面活性劑毒性比較低，較適合在食品中應(yīng)用。根據(jù)圖3可知，Tween-80效果最好，微乳區(qū)域面積最大。

合適的表面活性劑/助表面活性劑比例有利于微乳的形成。當(dāng)Km＝2時(shí)形成的微乳區(qū)面積最大。當(dāng)Km＜l時(shí)，微乳體系穩(wěn)定性下降，容易分層和混濁。Km＞1時(shí)，隨著Km的增加，微乳區(qū)域面積先增大再縮小，這是由于表面活性劑與助表面活性劑在最佳質(zhì)量配比時(shí)，助表面活性劑完全鑲嵌到表面活性劑中，形成的微乳結(jié)構(gòu)增溶空間最大，載油量最大；如表面活性劑的量繼續(xù)增加，無(wú)法形成較大的增溶空間，而且Km過(guò)大易形成凝膠和液晶區(qū)，導(dǎo)致微乳區(qū)減小[37]。在保證微乳液穩(wěn)定性及使用性能的前提下，應(yīng)盡可能減少表面活性劑的用量。

本實(shí)驗(yàn)同樣對(duì)微乳的理化性質(zhì)和穩(wěn)定性進(jìn)行考察，透射電子顯微鏡下觀(guān)察空白微乳及黃酮微乳的顆粒呈球形，粒徑比較均一，平均粒徑在10～100 nm之間，平均黏度為（2.58±0.07）mm2/s，符合微乳要求，適于應(yīng)用。穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所得到的微乳體系在常溫下可以存放3 個(gè)月，體系未發(fā)生性狀的變化。高、低溫穩(wěn)定性分析結(jié)果表明，在食品正常使用和保存溫度范圍內(nèi)，空白微乳與黃酮微乳體系均可以很好地保持原有性狀。

刺五加葉黃酮提取物對(duì)·OH、O2-·及DPPH自由基均有較好的清除作用，而當(dāng)用微乳作為刺五加葉黃酮化合物的載體時(shí)，其抗氧化能力進(jìn)一步增強(qiáng)，原因可能是：黃酮類(lèi)物質(zhì)含有多個(gè)羥基，耐堿性和抗光解能力差，化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，而用微乳包埋以后，黃酮分子均勻分布在微乳介質(zhì)中，增加了黃酮分子與被還原物質(zhì)的生物相容性，接觸的效率更高；同時(shí)微乳作為黃酮的載體，可以提高黃酮化合物的溶解度，Garti等用荷荷巴油微乳來(lái)增溶在水和油中都難溶的營(yíng)養(yǎng)素番茄紅素，結(jié)果表明其增溶能力為原來(lái)的20 倍[38]；此外，羥基數(shù)目對(duì)黃酮化合物的抗氧化能力有很大的影響，但是黃酮化合物的羥基暴露在外很容易被分解，導(dǎo)致其穩(wěn)定性變差，微乳包埋保護(hù)了黃酮物質(zhì)的酚羥基，導(dǎo)致黃酮微乳的抗氧化性?xún)?yōu)于黃酮溶液[39]。抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明刺五加葉黃酮微乳對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌以及熒光假單胞菌均有較好的抑制作用，并且其作用效果優(yōu)于刺五加葉黃酮空白對(duì)照。其原因除了微乳可提高黃酮類(lèi)物質(zhì)的穩(wěn)定性和保護(hù)生物活性外，已有研究證明微乳本身就有較好的抑菌作用[33]。