定點飽和突變改善米曲霉木聚糖酶的溫度特性

吳 芹，臧 嘉，胡 蝶，王 瑞，鄔敏辰

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

木聚糖酶（xylanases，EC 3.2.1.8）從木聚糖主鏈的內(nèi)部水解β-1，4-D-木糖苷鍵，是木聚糖降解酶系中的關(guān)鍵組分，廣泛存在于各種生物體中。隨著低聚木糖生理功能的發(fā)現(xiàn)、加酶飼料的興起及人類環(huán)保意識的增強(qiáng)，木聚糖酶在許多工業(yè)領(lǐng)域如食品、飼料、紡織和造紙等中的應(yīng)用潛力日趨凸顯[1-2]。目前商品化的木聚糖酶多為中溫酶，最適溫度在45～55℃范圍內(nèi)，然而酶在使用過程中經(jīng)常會遭遇或需要高溫環(huán)境，如在紙漿漂白和飼料造粒工藝中需要60～80℃的溫度，因此耐熱性差已成為制約木聚糖酶發(fā)展的瓶頸。

木聚糖酶主要?dú)w屬糖苷水解酶家族（glycoside hydrolase families，GHFs） 10 和 11，GHF11 木聚糖酶的三維結(jié)構(gòu)由一個α-螺旋、兩個反向平行的β-折疊片A和B及若干loops構(gòu)成，呈右手半握形狀[3]。隨著人們對木聚糖酶的結(jié)構(gòu)與功能及作用機(jī)理的認(rèn)識不斷深入，采用基因工程技術(shù)改造酶分子以獲得具有優(yōu)良酶學(xué)性質(zhì)的耐熱木聚糖酶的研究得到了快速發(fā)展。Zhang等[4]將Streptomyces olivaceoviridis木聚糖酶 SoxB的 N端與Thermomonospora fusca耐熱酶TfxA的對應(yīng)區(qū)域互換，獲得最適溫度和溫度穩(wěn)定性大幅度提高的雜合木聚糖酶STxAB。Ayadia等[5]將位于Trichoderma reesei木聚糖酶三維結(jié)構(gòu)表面的Ser單點和雙點突變?yōu)門hr，其中雙點突變酶（S80T-S149T）在55℃的半衰期由野生型酶的20 min延長至37 min。Qian等[6]對白蟻GHF11木聚糖酶XYL7實施定點飽和突變，獲得了兩個最適溫度均比野生型酶提高10℃的突變酶（XYL7-TC和XYL7-TS）。

Aspergillus oryzaeGHF11木聚糖酶AoXyn11A（GenBank：AFA51067）是一種具有優(yōu)良酶學(xué)性質(zhì)的生物催化劑，但其耐熱性較差[7]。本研究基于其三維結(jié)構(gòu)的同源建模和分子動力學(xué)模擬，擬將Gly21隨機(jī)替換為其他氨基酸。以pET-28a-Aoxyn11A為對象，對Aoxyn11A中編碼Gly21的密碼子實施飽和突變，構(gòu)建突變轉(zhuǎn)化子文庫，并從中獲得表達(dá)最高溫度穩(wěn)定性木聚糖酶的最優(yōu)突變轉(zhuǎn)化子。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒米曲霉 （Aspergillus oryzae）CICC40186：購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；大腸桿菌（Escherichia coli） BL21（DE3） 和表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）：購自Novagen公司；重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-Aoxyn11A和大腸桿菌轉(zhuǎn)化子E.coli/Aoxyn11A：由作者所在實驗室構(gòu)建和保藏。

1.1.2 主要試劑和引物 PrimeSTAR DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶 DpnⅠ、DNA Marker和蛋白質(zhì)Marker：購自大連TaKaRa公司；IPTG、胰蛋白胨和酵母提取物：購自上海Sangon公司；D-木糖、樺木木聚糖和考馬斯亮藍(lán)R-250：Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。PCR引物委托Sangon公司合成見表1，用于Aoxyn11A的定點飽和突變。

表1 Aoxyn11A定點飽和突變的PCR引物Table 1 PCR primers for the site-saturated mutagenesis of Aoxyn11A

1.1.3 培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基：1 g/dL胰蛋白胨、0.5 g/dL 酵母提取物和 1 g/dL NaCl，pH 7.2；LB 固體培養(yǎng)基：添加1.8 g/dL的瓊脂粉；LB抗性培養(yǎng)基：添加終濃度為100 μg/mL的卡那霉素。

1.2 實驗方法

1.2.1 同源建模和分子動力學(xué)模擬在PDB數(shù)據(jù)庫中搜索與AoXyn11A一級結(jié)構(gòu)同源性高的且已知晶體結(jié)構(gòu)的GHF11木聚糖酶，選取其中的3種晶體結(jié)構(gòu) （PBD：1TE1，2VUL和 1ENX）為模板， 運(yùn)用SALIGN多空間結(jié)構(gòu)比對程序（http：//salilab.org/DBAli/?page=tools_&action=f_salign）和 MODELLER 9.11 建模程 序 （http：//salilab.org/modeller/） 進(jìn)行AoXyn11A三維結(jié)構(gòu)的多模板同源建模及優(yōu)化。運(yùn)用 GROMACS 4.5 程序包（http：//www.gromacs.org/）并參照Yin等[8]的方法對AoXyn11A的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子動力學(xué)（molecular dynamics，MD） 模擬，選擇將最高溫度因子B-factor值位點處的Gly21隨機(jī)替換為其他氨基酸。

1.2.2 突變轉(zhuǎn)化子文庫的構(gòu)建和篩選以pET-28a-Aoxyn11A為模板、G21X-F和X11-R為引物，采用全質(zhì)粒兩步PCR（two-stage whole-plasmid PCR）[9]對Gly21密碼子實施飽和突變。將pET-28a-Aoxyn11A突變體用DpnⅠ消化，轉(zhuǎn)化E.coliBL21，構(gòu)建突變轉(zhuǎn)化子文庫。從文庫中挑選96個轉(zhuǎn)化子（E.coli/Aoxyn11AG21X，X代表任意氨基酸），接種于500 μL LB抗性培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，以2%接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接相同的培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600約為0.8時，加入0.5 mmol/L IPTG，16℃誘導(dǎo)表達(dá)8 h。離心收集菌體，用檸檬酸-Na2HPO4緩沖液（50 mmol/L、pH 5.5）懸浮，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，上清液作為粗酶液。將酶液60℃保溫20 min，適當(dāng)稀釋后取5 μL加入95 μL 0.5 g/dL樺木木聚糖溶液（相同緩沖液配制）中，借助PCR儀進(jìn)行催化和顯色反應(yīng)（50 ℃ 15 min，加 50 μL DNS 試劑，95 ℃5 min，冷卻至10℃）。加入96孔板中，用酶標(biāo)儀測定OD540nm值。殘余酶活性大于50%的突變木聚糖酶所對應(yīng)的轉(zhuǎn)化子定義為正突變子，對其進(jìn)行DNA測序。延長60℃保溫時間，從正突變子中獲得最優(yōu)突變轉(zhuǎn)化子。

1.2.3 木聚糖酶的純化按上述方法分別將E.coli/Aoxyn11A和最優(yōu)突變轉(zhuǎn)化子在30 mL LB抗性培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用3 mL檸檬酸-Na2HPO4緩沖液重懸菌體，冰浴超聲波破碎細(xì)胞，上清液在4℃用Ni-NAT親和層析柱 （北京Tiandz公司）純化目的酶蛋白。采用SDS-PAGE分析重組表達(dá)產(chǎn)物。

1.2.4 木聚糖酶活性的測定參照Bai等[10]的方法并略作修改。在2.4 mL 0.5%樺木木聚糖溶液（pH 5.5、50 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制）中加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，50℃反應(yīng)15 min，再加入2.5 mL DNS試劑，沸水浴顯色7 min，測定OD540nm值。在上述反應(yīng)條件下，1個木聚糖酶活性單位（U）定義為每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖 （以D-木糖計）所需的酶量。

1.2.5 木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)的分析

1）溫度對酶活性的影響：在不同溫度（45～75℃）下，按1.2.4的方法測定木聚糖酶活性。最適溫度定義為最高酶活性（相對酶活性100%）所對應(yīng)的溫度。將酶液在35～65℃下處理1 h，按1.2.4的方法測定殘余木聚糖酶活性，未經(jīng)處理酶液的酶活性以100%計。溫度穩(wěn)定性定義為殘余酶活性大于85%所對應(yīng)的溫度。

2）pH對酶活性的影響：用pH 3.5～7.5的緩沖液配制0.5%樺木木聚糖溶液，按1.2.4的方法測定木聚糖酶活性。最適pH定義為最高酶活性所對應(yīng)的pH值。將酶液在pH 3.5～7.5、35℃下處理1 h，按1.2.4的方法測定殘余木聚糖酶活性。pH穩(wěn)定性定義為殘余酶活性在85%以上所對應(yīng)的pH范圍。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析實驗結(jié)果以 “均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（x±s）表示，應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 AoXyn11A三維結(jié)構(gòu)的同源建模

已知晶體結(jié)構(gòu)的GHF11木聚糖酶與AoXyn11A的一級結(jié)構(gòu)同源性均小于72%，因此本研究選取同源性相對較高、分別源自Penicillium funiculosum（1TE1）、E.coli（2VUL） 和Hypocrea jecorina（1ENX）的3種木聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)作為模板，采用SALIGN和MODELLER 9.11進(jìn)行AoXyn11A三維結(jié)構(gòu)的多模板同源建模及優(yōu)化，見圖1。已有研究表明，目標(biāo)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)同源建模的準(zhǔn)確度主要取決于其與模板蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)同源性高低，當(dāng)同源性不高時，單模板同源建模的準(zhǔn)確度較低[11]。

2.2 擬隨機(jī)替換位點的選定

蛋白質(zhì)構(gòu)象的剛性與其各位點處氨基酸的B-factor值成負(fù)相關(guān)性[12]。運(yùn)用GROMACS 4.5對AoXyn11A三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了MD模擬，計算出各氨基酸的B-factor值，見圖2。由圖2可見，AoXyn11A中 Gly21的 B-factor值最高 （70.27 ?）， 故選定將Gly21隨機(jī)替換為其他氨基酸。

圖1 AoXyn11A的三維結(jié)構(gòu)模型Fig.1 Three-dimensional structure model of AoXyn11A

圖2 AoXyn11A各位點處氨基酸殘基的溫度因子B-factor值Fig.2 B-factor values of amino acid residues in the sites of AoXyn11A

2.3 最優(yōu)突變轉(zhuǎn)化子的獲得

將E.coli/Aoxyn11A和96個E.coli/Aoxyn11AG21X所表達(dá)的木聚糖酶在60℃保溫20 min，測定殘余酶活性。結(jié)果顯示，AoXyn11A活性完全喪失，而4種突 變 酶 （AoXyn11AG21I、AoXyn11AG21F、AoXyn11AG21V和AoXyn11AG21L）的殘余活性大于50%，見圖3。延長保溫時間至30 min，測得4種酶的殘余活性分別為57.3、39.3、30.5和37.1%，從而獲得了最優(yōu)突變轉(zhuǎn)化子E.coli/Aoxyn11AG21I。

2.4 木聚糖酶的純化和分析

E.coli/Aoxyn11A和E.coli/Aoxyn11AG21I經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和超聲波破碎細(xì)胞，上清液采用Ni-NAT柱純化目的酶蛋白。SDS-PAGE分析顯示，純化的AoXyn11A和AoXyn11AG21I均約在相對分子質(zhì)量24 100處呈現(xiàn)單一條帶（圖4泳道2和4）。

圖3 AoXyn11A及其4種代表性突變酶N端的30個氨基酸殘基Fig.3 N-terminal 30 amino acid residues of AoXyn11A and its four representative mutants

圖4 大腸桿菌轉(zhuǎn)化子表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expressed products in E.coli transformants

2.5 木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)的分析

2.5.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性溫度對AoXyn11A和AoXyn11AG21I活性的影響見圖5。由圖5（a）可見，AoXyn11AG21I的最適溫度為65℃，較AoXyn11A提高了 10℃；由圖 5（b）可見，AoXyn11AG21I和AoXyn11A分別在48、55℃及以下穩(wěn)定。測定結(jié)果表明，將AoXyn11A中的Gly21替換為Ile21明顯改善了其溫度特性。

圖5 AoXyn11A和AoXyn11AG21I的最適溫度和溫度穩(wěn)定性Fig.5 Temperature optima and stabilities of AoXyn11A and AoXyn11AG21I

2.5.2 最適pH和pH穩(wěn)定性分析了pH對AoXyn11A和AoXyn11AG21I活性的影響。AoXyn11A和AoXyn11AG21I的最適pH均為5.5；在pH 5.0～7.0范圍內(nèi)殘余酶活性均大于85%。測定結(jié)果表明，Gly21替換為Ile21對AoXyn11A的pH特性改變不大。

2.6 木聚糖酶三維結(jié)構(gòu)的分析

Gly側(cè)鏈僅有一個氫原子，由于缺乏長側(cè)鏈的約束，致使多肽鏈在Gly殘基位點處呈現(xiàn)柔性構(gòu)象；另外，Gly具有最高的構(gòu)象熵，在解折疊過程中所需能量最少。因此，將特定位點處的Gly突變?yōu)槠渌被峥捎行Ц纳艷HF11木聚糖酶溫度特性[13]。由圖1可見，Gly21使AoXyn11A在該位點處的柔性較強(qiáng)，導(dǎo)致其溫度穩(wěn)定性較差。將Gly21突變?yōu)镮le21（支鏈氨基酸）提高了AoXyn11A構(gòu)象的剛性并降低了熵，對改善其溫度特性起促進(jìn)作用。

AoXyn11A的Gly21位于連接β折疊股B2和A2的 loop上。運(yùn)用 PIC程序（http：//pic.mbu.iisc.ernet.in/）分析AoXyn11A和AoXyn11AG21I構(gòu)象中存在的作用力。結(jié)果表明，除了共同存在的疏水作用外，AoXyn11A中P3-F16和I58-V74形成了2對疏水作用； 而 AoXyn11AG21I中 I21-V41、Y34-V172、Y71-L72、A73-I87、V74-V172、Y102-I115、Y113-I115、I115-L162和W157-Y160形成了9對疏水作用。另外，AoXyn11AG21I較AoXyn11A多出了3對氫鍵和1對鹽橋（E84-R120）。許多研究表明，疏水作用、氫鍵、鹽橋和二硫鍵等對酶的熱穩(wěn)定性起重要作用[14]。

3 結(jié) 語

酶在各領(lǐng)域的應(yīng)用常受限于其熱穩(wěn)定性差，如何獲得性質(zhì)優(yōu)良的耐熱酶已成為研究人員所面臨的挑戰(zhàn)。基因工程技術(shù)中的定點飽和突變在改善酶學(xué)性質(zhì)如溫度和pH特性、比活性、對映和區(qū)域選擇性及底物特異性等方面?zhèn)涫荜P(guān)注。本研究基于生物數(shù)據(jù)庫的相關(guān)數(shù)據(jù)并借助多種生物軟件對AoXyn11A的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行多模板同源建模和分子動力學(xué)模擬，設(shè)計將其最高溫度因子B-factor值處的Gly21隨機(jī)替換為其他氨基酸，采用定點飽和突變技術(shù)構(gòu)建了轉(zhuǎn)化子文庫，篩選獲得了的最優(yōu)突變酶轉(zhuǎn)化子AoXyn11A。與AoXyn11A相比，突變酶AoXyn11AG21I的最適溫度和溫度穩(wěn)定性有明顯的提高。本設(shè)計方案為木聚糖酶及其它酶蛋白的熱穩(wěn)定性定向改造提供了一種新的途徑。