產(chǎn)耐熱β-半乳糖苷酶蜜源芽孢桿菌的鑒定及酶學(xué)性質(zhì)

李 云 ， 朱少華 ，管政兵 ，蔡宇杰 ， 廖祥儒 *

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

關(guān)鍵字：β-半乳糖苷酶；酶學(xué)性質(zhì)；地衣芽孢桿菌

β-半乳糖苷酶 （β-galactosidase，EC 3.2.1.23），又稱乳糖酶（Lactase），是一種重要的生物催化劑，具有催化乳糖水解和轉(zhuǎn)糖苷兩種重要的功能。工業(yè)上常利用其水解活性來(lái)減少乳制品中的乳糖含量及廢水處理，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。β-半乳糖苷酶廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中[1-2]。細(xì)菌、霉菌、酵母等微生物均有β-半乳糖苷酶的發(fā)現(xiàn)[2]，而在乳酸菌、大腸桿菌和芽孢桿菌[3-4]等細(xì)菌中分布最為廣泛。目前，來(lái)源于微生物的β-半乳糖苷酶?jìng)涫荜P(guān)注，因具有酶源豐富、產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、周期短等特點(diǎn)，而且生產(chǎn)不受季節(jié)、地理位置等因素的影響等[5]。因此，與其它來(lái)源相比，微生物來(lái)源的β-半乳糖苷酶在工業(yè)應(yīng)用中極具優(yōu)勢(shì)。例如，乳品工業(yè)用于分解乳糖的β-半乳糖苷酶多來(lái)源于酵母、米曲霉、黑曲霉或乳酸菌。但以上來(lái)源的β-半乳糖苷酶往往存在穩(wěn)定性差[6]以及酶活易受到降解產(chǎn)物葡萄糖或半乳糖的抑制，會(huì)限制β-半乳糖苷酶的工業(yè)應(yīng)用[7-8]。因此，篩選具有高穩(wěn)定性、耐受高濃度葡萄糖或半乳糖的β-半乳糖苷酶十分必要。

近年來(lái)，耐熱β-半乳糖苷酶在乳制品生產(chǎn)中具有顯著優(yōu)勢(shì)，并逐漸引起人們的研究興趣。一般把最適溫度在50℃以上的β-半乳糖苷酶稱作耐熱β-半乳糖苷酶。例如，來(lái)源于嗜熱菌和霉菌的乳糖酶就具有較高的反應(yīng)溫度[9]。對(duì)芽孢桿菌來(lái)源的β-半乳糖苷酶的研究也逐步深入，已發(fā)現(xiàn)的特性有高轉(zhuǎn)糖基活性、熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性[10-13]。除了熱穩(wěn)定性外，耐高濃度葡萄糖或半乳糖抑制的β-半乳糖苷酶也是應(yīng)用中急需的，而這方面的工作尚不深入[8]。有研究表明，蜂蜜來(lái)源的芽孢桿菌產(chǎn)生的果聚糖合酶具有較好的高糖耐受性[14]。Esawy的研究認(rèn)為，蜂蜜是葡萄糖和果糖構(gòu)成的糖過(guò)飽和溶液，其中分離的芽孢桿菌及其產(chǎn)生的酶等生物大分子很可能具有較好的糖耐受性。因此，作者以分離自蜂蜜的芽孢桿菌為資源，從中得到能夠產(chǎn)耐高濃度單糖的β-半乳糖苷酶的安全菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏蜜源菌，是從蜂蜜中分離得到的芽孢桿菌菌株。

1.1.2 試劑乳糖、胰蛋白胨、酵母膏、ZnCl2、NaCl、KH2PO4、 K2HPO4·3H2O、CaCl2·2H2O、CuCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、BaCl2·2H2O、KCl、MnCl2·4H2O、NiSO4·6H2O及CoCl2·6H2O：均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；鄰硝基?β-D-半乳糖苷（ONPG）、鄰硝基酚（ONP）：購(gòu)買于上海生工；考馬斯亮藍(lán)R250：上?；瘜W(xué)試劑公司進(jìn)口分裝。

1.1.3 儀器與設(shè)備紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-6000 METASH：上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；PCR儀：美國(guó)Applied Biosystems產(chǎn)品；DYY-8C電泳儀、DNA水平電泳槽：北京六一儀器廠；立式蒸氣壓力滅菌鍋：YXQ-LS-50上海博迅公司產(chǎn)品；組合式搖床：太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；培養(yǎng)箱：LRH-250廣東省醫(yī)療器械廠；恒溫水浴鍋：常州中誠(chéng)儀器制造有限公司；超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；JG-1A型高壓細(xì)胞破碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種鑒定

1）形態(tài)學(xué)和生理生化特征鑒定：將待測(cè)菌株劃線于LB固體培養(yǎng)基，在30℃下培養(yǎng)2 d，利用電子顯微鏡觀察菌株的形態(tài)。根據(jù)《伯杰細(xì)菌手冊(cè)》、《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》（第二版）中的方法對(duì)其生理生化特性進(jìn)行測(cè)定。

2）16S rRNA基因鑒定：采用16S rRNA基因序列分析法，按試劑盒說(shuō)明提取細(xì)菌DNA并以通用引物 F27 （5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和R1492（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因，擴(kuò)增產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序，序列測(cè)定結(jié)果通過(guò)BLAST進(jìn)行同源比對(duì)分析，選取高同源性序列，利用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建中采用鄰接法（Neighbor-Joining method），并重復(fù)取樣1 000次進(jìn)行自展值（bootstrap value）分析，以評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的置信度，確定菌種在進(jìn)化過(guò)程中的位置[15]。

1.2.2 β-半乳糖苷酶活力的測(cè)定

1）粗酶液的制備：芽孢桿菌hb15液態(tài)發(fā)酵48 h后，取發(fā)酵液15 mL，于4℃、8 000 r/min離心10 min，收集菌體，用 0.1 mol/L、pH 7.0磷酸緩沖液洗滌兩次。采用高壓破碎，再于4℃、8 000 r/min離心10 min，上清液作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的粗酶液。

2）酶活的測(cè)定：采用ONPG法，0.5 mL、pH 7.0的磷酸緩沖液和1.5 mL 0.25%的ONPG加入試管，30℃預(yù)熱5 min，加入1 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液，反應(yīng)30 min后，加入1 mL 10%Na2CO3終止反應(yīng)，用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值（在波長(zhǎng)420 nm處），以磷酸緩沖液代替酶液作對(duì)照[16]。

酶活定義：在上述條件下，1 min催化水解ONPG生成1 μmol ONP的量，定義為1 U。

通過(guò)對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.828 3X－0.001 2（R2=0.999 9），以吸光度（OD 值）為縱坐標(biāo)Y，ONP濃度為橫坐標(biāo)X計(jì)算酶活。

1.2.3 酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

1）酶的純化：將粗酶液經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)鹽析、HiTrap Q HP離子交換層析和Superdex G-200 10/300 GL凝膠過(guò)濾層析等方法進(jìn)行分離純化，得到純酶，研究其酶學(xué)性質(zhì)。

2）β-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)溫度：將酶液分別在 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃下與底物進(jìn)行反應(yīng)，然后參照1.2.2所述測(cè)定其酶活力，以最高酶活定義為100%，分別計(jì)算不同溫度條件下β-半乳糖苷酶的相對(duì)酶活。

3）β-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性：將酶液在30、40、50、60、70、80 ℃下分別放置 0.5、1.0、1.5、2.0 h，然后參照1.2.2所述測(cè)定其剩余酶活力，以初始酶活定義為100%，分別計(jì)算不同溫度條件下放置不同時(shí)間的β-半乳糖苷酶的相對(duì)酶活。

4）β-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)pH：在最適溫度條件下，測(cè)定β-半乳糖苷酶在不同pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）下的酶活。將最高的酶活力定義為100%，分別計(jì)算不同pH值條件下β-半乳糖苷酶的相對(duì)酶活。

5）β-半乳糖苷酶的pH穩(wěn)定性：將酶液的pH分 別 調(diào) 至 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，于 4 ℃下放置 4.0、8.0、12.0、16.0 h后，再將酶液 pH調(diào)至最適pH，然后參照1.2.2所述在最適溫度和最適pH條件下測(cè)定其酶活，分別計(jì)算不同pH條件下放置不同時(shí)間β-半乳糖苷酶的相對(duì)酶活。

6）金屬離子對(duì)β-半乳糖苷酶的影響：酶液中分別加入不同的金屬離子 （Na+、K+、Co2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ba2+、Ni2+），使其終濃度為 2 mmol/L，4℃下放置5 min后，在最適溫度和最適pH下測(cè)定酶活力，將不添加離子的酶活力定義為100%，分別計(jì)算不同離子條件下β-半乳糖苷酶的相對(duì)酶活性，考察金屬離子對(duì)酶活的影響。

7）酶反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)：在最適的反應(yīng)溫度和pH條件下，酶液與不同濃度的底物反應(yīng)，其中ONPG 的 濃 度 為 0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mmol/L，參照1.2.2所述測(cè)定β-半乳糖苷酶水解酶活，之后采用Linewear-Burk雙倒數(shù)作圖，研究該β-半乳糖苷酶催化ONPG水解的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)，求出β-半乳糖苷酶水解活性的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vmax。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種鑒定

對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的127株蜜源菌，利用X-gal平板篩選培養(yǎng)基初篩，30℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)后觀察，看是否有藍(lán)色菌落出現(xiàn)。初篩得到3株菌，之后以O(shè)NPG為底物測(cè)酶活復(fù)篩，見(jiàn)表1。最終選取一株產(chǎn)β-半乳糖苷酶高的菌株，其編號(hào)hb15，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定。

表1 各菌株酶活Table1 β-galactosidase activity of each strain

2.1.1 形態(tài)學(xué)和生理生化特征鑒定菌株hb15在LB培養(yǎng)基上形成圓形菌落，邊緣不整齊，生長(zhǎng)初期表面光滑，后期表面粗糙，有褶皺，菌體桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，大小為 0.8 μm×1.5 μm，以端生鞭毛運(yùn)動(dòng)，形成芽孢。其生理生化特征見(jiàn)表2。

表2 菌株hb15的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of hb15

2.1.2 16S rRNA基因克隆及其序列分析PCR擴(kuò)增獲得菌株hb15的16S rRNA核苷酸片段，大小為1 438 bp。將其進(jìn)行BLAST同源性序列比對(duì)，結(jié)果表明該序列與多個(gè)已發(fā)表的芽孢桿菌菌株的16S rRNA基因序列的相似性達(dá)到99%以上，如BacilluslicheniformisXmb047和BacilluslicheniformisML103A。選取7株模式菌和兩株序列相似度高的菌株，通過(guò)MEGA4.0軟件進(jìn)行聚類分析和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，結(jié)果見(jiàn)圖1。

結(jié)合該菌株的生理生化鑒定結(jié)果，確定該菌株為芽孢桿菌屬中的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）， 命名為Bacillus licheniformisSYBC hb15。

圖1 基于16S rRNA基因序列對(duì)目的細(xì)菌構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of the target strain based on 16S rRNA gene-sequencing analysis

2.2 β-半乳糖苷酶的分離純化

2.2.1 硫酸銨飽和度的確定將粗酶液經(jīng)不同飽和度的硫酸銨沉淀后，測(cè)定上清液β-半乳糖苷酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 硫酸銨分級(jí)鹽析Fig.2 Ammonium sulphate salt fractionation

由圖2可知，硫酸銨飽和度低于30%時(shí)，上清液中β-半乳糖苷酶活力基本沒(méi)有下降；飽和度高于30%，上清液中的酶活開(kāi)始下降，至60%飽和度時(shí)基本檢測(cè)不到β-半乳糖苷酶活力，此時(shí)β-半乳糖苷酶沉淀完全。因此，確定β-半乳糖苷酶的硫酸銨分級(jí)鹽析方法為：首先加入硫酸銨粉末至飽和度30%去除部分雜蛋白質(zhì)，然后再添加硫酸銨粉末至飽和度60%沉淀β-半乳糖苷酶，用于后續(xù)的純化。

2.2.2 HiPrepTM26/10 Desalting對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行脫鹽將硫酸銨沉淀得到的蛋白質(zhì)溶于小體積的磷酸鹽緩沖液，用HiPrepTM26/10 Desalting脫鹽柱進(jìn)行脫鹽，脫鹽柱是分子篩層析柱，β-半乳糖苷酶的脫鹽柱層析見(jiàn)圖3。將有β-半乳糖苷酶活力的活性峰收集，進(jìn)行下一步的離子交換層析。

圖3 β-半乳糖苷酶的脫鹽柱層析Fig.3 Hi PrepTM 26/10 Desalting for β-galactosidase

2.2.3 離子交換柱層析據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)菌產(chǎn)β-半乳糖苷酶的等電點(diǎn)在5.7～6.0，pH的穩(wěn)定范圍6.0～8.0[17]，因此選擇了陰離子交換柱HiTrap Q HP對(duì)β-半乳糖苷酶進(jìn)一步分離純化，經(jīng)優(yōu)化條件選擇緩沖液的pH為7，此時(shí)β-半乳糖苷酶帶負(fù)電，上樣之后結(jié)合到柱子上，梯度洗脫時(shí)隨著鹽離子的濃度增加酶被洗脫下來(lái)。

β-半乳糖苷酶經(jīng)過(guò)陰離子交換柱層析結(jié)果見(jiàn)圖4。確定梯度洗脫，在NaCl質(zhì)量濃度為30 g/dL時(shí)酶被洗脫下來(lái)，將具有β-半乳糖苷酶活力的活性峰收集，超濾管濃縮，4℃保存，待進(jìn)行Superdex G-200分子篩層析。

圖4 β-半乳糖苷酶的HiTrap Q HP離子交換層析Fig.4 HiTrap Q HP ion exchange chromatography for β-galactosidase

2.2.4 凝膠過(guò)濾層析據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，微生物β-半乳糖苷酶的相對(duì)分子質(zhì)量范圍廣，在35 000～850 000[18-19]，因此選擇 Superdex G-200 10/300 GL凝膠柱做進(jìn)一步的分離純化。如圖5所示，對(duì)各洗脫峰的酶活測(cè)定，經(jīng)檢測(cè)洗脫體積11～15 mL處洗脫出的單峰具有β-半乳糖苷酶酶活，收集活性峰，之后利用SDS-PAGE進(jìn)行驗(yàn)證。

圖5 β-半乳糖苷酶的superdex G-200凝膠過(guò)濾層析Fig.5 Superdex G-200 gel chromatography for βgalactosidase

利用凝膠過(guò)濾層析測(cè)定酶的相對(duì)分子質(zhì)量，將該酶在Superdex G-200 10/300 GL凝膠柱中的洗脫體積12.460 5 mL代入到凝膠過(guò)濾蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線lgMw=－2.991Kav+5.936，Kav=（Vc－Vo）/（Vt－Vo），得到該酶的相對(duì)分子質(zhì)量為114 500。

2.2.5 β-半乳糖苷酶分離純化各步驟的總結(jié)B.licheniformisSYBC hb15產(chǎn)β-半乳糖苷酶的各步的分離純化的結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 B.licheniformis SYBC hb15產(chǎn)β-半乳糖苷酶的分離純化結(jié)果Table 3 Purification of β-galactosidase from B.licheniformis SYBC hb15

由表3可知，粗酶經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、離子交換層析以及凝膠過(guò)濾層析等步驟分離純化后，比酶活提高到121.4 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)38.65，回收率為31.48%。

將純化各步驟所得的組分進(jìn)行變性蛋白質(zhì)電泳SDS-PAGE，結(jié)果見(jiàn)圖6。經(jīng)凝膠過(guò)濾層析收集到的樣品在電泳圖中呈現(xiàn)一條帶，達(dá)到電泳純。電泳純度的β-半乳糖苷酶的遷移率Rf為0.771 1，相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線lgMw=－0.994 3Rf+5.523 0，求出該β-半乳糖苷酶的相對(duì)分子質(zhì)量為57 000。結(jié)合凝膠過(guò)濾層析測(cè)定的相對(duì)分子質(zhì)量約為114 500，推斷該β-半乳糖苷酶為一個(gè)二聚體蛋白質(zhì)。

圖6 β-半乳糖苷酶的SDS-PAGEFig.6 SDS-PAGE for purified β-galactosidase

2.3 β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 β-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)溫度由圖7可知，B.licheniformisSYBC hb15發(fā)酵產(chǎn)的β-半乳糖苷酶隨溫度升高催化活性增強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到60℃時(shí)，酶活力最高，是30℃時(shí)酶活的10倍。溫度繼續(xù)升高，酶活開(kāi)始下降。因此，此β-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為60℃。

圖7 β-galactosidase的最適反應(yīng)溫度Fig.7 Optimal reaction temperature of β-galactosidase

報(bào)道認(rèn)為芽孢桿菌等細(xì)菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶最適催化溫度一般為50～70℃[9]，如表4所示，部分芽孢桿菌屬的菌株所產(chǎn)該酶的最適反應(yīng)溫度較高，同樣嗜熱菌及真菌中霉菌所產(chǎn)的該酶也有很高的最適反應(yīng)溫度。在高溫下，有利于縮短水解反應(yīng)時(shí)間和減少污染的風(fēng)險(xiǎn)[20]。

表4 不同微生物來(lái)源的β-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)溫度Table 4 β-galactosidases from different microbial sources and its optimal reaction temperature

2.3.2 β-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性由圖8可知，β-半乳糖苷酶在30～50℃水浴放置0.5～2 h，酶活力下降在10%以內(nèi)。但在60℃水浴放置0.5 h后下降了25%，之后酶活力下降不顯著；在70℃以上，酶活力下降明顯，80℃下水浴0.5 h后酶幾乎完全喪失活性。相比之前報(bào)道的Bacillus licheniformisDSM 13、Bifidobacterium longum和Bacillus megaterium2-37-4-1所產(chǎn)的酶有更高的熱穩(wěn)定性[21-22，27]。

圖8 β-galactosidase的溫度穩(wěn)定性Fig.8 Thermostability of β-galactosidase

β-半乳糖苷酶是一種蛋白質(zhì)，它的活性主要由具有特殊空間結(jié)構(gòu)的活性中心決定，故其酶活的穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)相關(guān)。而加熱會(huì)改變蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)而使蛋白質(zhì)變性，造成β-半乳糖苷酶失去活性。在食品實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中一般要保持一定的溫度以控制發(fā)酵周期與產(chǎn)品品質(zhì)，因此要求所用的酶制劑必須具有較好熱穩(wěn)定性，從而β-半乳糖苷酶能夠更好的發(fā)揮作用[28]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，B.licheniformisSYBC hb15發(fā)酵產(chǎn)的β-半乳糖苷酶具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，具有良好的應(yīng)用前景。

2.3.3 β-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)pH由圖9可知，B.licheniformisSYBC hb15發(fā)酵產(chǎn)的β-半乳糖苷酶在pH 5.0～9.0范圍內(nèi)活性較高，但pH低于或高于6.0酶活力迅速下降，pH 6.0時(shí)表現(xiàn)出最高的催化能力，因此pH 6.0是最適反應(yīng)pH，但當(dāng)pH小于5.0或超過(guò)9.0時(shí)，酶基本失去了活力。一般認(rèn)為細(xì)菌產(chǎn)的β-半乳糖苷酶的最適pH介于6.0～7.5。

圖9 β-galactosidase的最適反應(yīng)pHFig.9 Optimal reaction pH value of β-galactosidase

2.3.4 β-半乳糖苷酶的pH穩(wěn)定性由圖10可知，B.licheniformisSYBC hb15發(fā)酵產(chǎn)β-半乳糖苷酶在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)，酶活力較穩(wěn)定。而Chunli Song報(bào)道的Guehomyces pullulans17-1所產(chǎn)β-半乳糖苷酶在pH 4.0～5.0之間有較高的活性并保持相對(duì)穩(wěn)定。pH是β-半乳糖苷酶最重要的環(huán)境因素之一，對(duì)酶活性產(chǎn)生較大影響。當(dāng)pH過(guò)高或過(guò)低時(shí)會(huì)通過(guò)改變酶活性中心而影響酶活性。因此為了使酶發(fā)揮最佳催化效果，必須了解其最適pH及其穩(wěn)定性，并在實(shí)際應(yīng)用中合理控制催化環(huán)境。

圖10 β-galactosidase的pH穩(wěn)定性Fig.10 pH stability of β-galactosidase

2.3.5 金屬離子對(duì)β-半乳糖苷酶酶活的影響分別加入不同金屬離子，測(cè)定其相對(duì)酶活力，見(jiàn)表5。結(jié)果顯示：金屬離子中K+對(duì)β-半乳糖苷酶酶活有明顯的激活作用，可能K+會(huì)在β-半乳糖苷酶中形成鹽橋從而穩(wěn)定酶的立體結(jié)構(gòu)，在一定程度上提高了酶活性。而Na+對(duì)酶活力幾乎無(wú)影響，Mg2+、Ba2+、Zn2+、Ni2+有一定抑制作用，Co2+、 Cu2+、Ca2+、Mn2+對(duì)酶活力有強(qiáng)烈抑制作用，特別是Ca2+、Mn2+的抑制作用很強(qiáng)，可能它們破壞了酶活性中心，使蛋白質(zhì)變性，酶活降低[28-29]。

表5 金屬離子對(duì)β-galactosidase活性的影響Table 5 Effects of metal ions on β-galactosidase activity

2.3.6 單糖對(duì)β-半乳糖苷酶酶活的影響由圖11可知，半乳糖和葡萄糖對(duì)β-半乳糖苷酶的水解酶活有一定的影響?？梢钥闯?，葡萄糖對(duì)該酶的水解酶活具有較弱的抑制作用，相對(duì)水解酶活均大于50%，而半乳糖對(duì)水解酶活具有較強(qiáng)的抑制作用，低濃度下就會(huì)使酶活降低到10%。Yi-Ning Dong報(bào)道半乳糖對(duì)β-半乳糖苷酶水解ONPG抑制作用比葡萄糖的強(qiáng)[30]，也有報(bào)道的理論與此相反[31]，并且葡萄糖對(duì)水解酶活的抑制作用隨濃度的增大越來(lái)越顯著。

圖11 葡萄糖和半乳糖對(duì)β-galactosidase活性的影響Fig.11 Effectsofglucoseandgalactoseonβgalactosidase activity

葡萄糖濃度為0.6 mol/L時(shí)，本研究酶的相對(duì)酶活為55.6%，與陳真真報(bào)道的同樣葡萄糖濃度下宋氏志賀氏菌ShigellasonneiSK22.001所產(chǎn)的酶相對(duì)酶活55%相當(dāng)[16]，但蜜源菌株B.licheniformisSYBC hb15所產(chǎn)酶的安全性更好。Lactobacillus reuteri在半乳糖濃度200 mmol/L時(shí)相對(duì)酶活為45%，在葡萄糖濃度170 mmol/L時(shí)相對(duì)酶活為95%[32]，而在葡萄糖濃度僅10 mmol/L時(shí)，所研究酶的相對(duì)酶活高于Talaromyces thermophilusCBS 236.58所產(chǎn)酶的58.3%[31]和Bifidobacterium longumCCRC 15708所產(chǎn)酶的97.5%[27]。同時(shí)，低聚糖合成過(guò)程中，半乳糖被大量消耗，使半乳糖的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于葡萄糖的含量，會(huì)降低其對(duì)酶的抑制作用。

2.3.7 β-半乳糖苷酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km是酶的一個(gè)特征常數(shù)，Km的大小只與酶的性質(zhì)有關(guān)，與酶濃度無(wú)關(guān)。Km近似表示酶與底物結(jié)合的親和力大小，即Km值愈小，則酶與底物的親和力愈大；反之，則越小。

由圖12的回歸方程求得該酶對(duì)ONPG的特征常數(shù)Km為 4.853 mmol/L，最大反應(yīng)速率Vmax為14.705 μmol/（min·mg）。 Onladda Juajun 等報(bào)道的此酶以O(shè)NPG為底物時(shí)Km為13.7 mmol/L[21]，另有Bacillus megaterium的 9.5 mmol/L[22]和BacillusNo.C-125 的 9.26 mmol/L[33]，但Bacillus coagulans的僅為4.2 mmol/L[20]?？梢?jiàn)該酶對(duì)底物ONPG的親和性較大。（y代表1/V，x代表1/S）

圖12 β-半乳糖苷酶對(duì)ONPG的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.12 Lineweaver-Burk plot of β-galactosidase using ONPG as substrate

3 結(jié)語(yǔ)

篩選到一株可產(chǎn)β-半乳糖苷酶的蜜源芽孢桿菌，對(duì)其進(jìn)行生理生化及16S rRNA鑒定確定為地衣芽孢桿菌，在此基礎(chǔ)上分離純化酶，進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果表明：β-半乳糖苷酶的最適水解反應(yīng)溫度是60℃；該酶具有較高的熱穩(wěn)定性；最適反應(yīng)pH為6，在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)酶活穩(wěn)定；K+對(duì)此酶有明顯激活作用；當(dāng)葡萄糖濃度為0.6 mol/L時(shí)，酶活力仍然保持50%以上。因此，B.licheniformisSYBC hb15所產(chǎn)β-半乳糖苷酶屬于一種耐熱、耐葡萄糖的β-半乳糖苷酶。