體外法評(píng)估9種植物精油對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌效果研究

◆作者：歐陽(yáng)海燕 沈兆艷 呂勇 吳世林

◆單位：廣州智特奇生物科技股份有限公司

由于藥物的殘留、病原菌的耐藥性等問(wèn)題，抗生素逐漸被限制在飼料中使用。植物精油以其天然、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)可成為抗生素的替代品。國(guó)內(nèi)外研究表明，天然植物精油對(duì)日常生產(chǎn)生活中的致病菌有很好的抑制作用。Fang等（2009）報(bào)道，將 1g/kg刺五加精油添加到21日齡斷奶仔豬的飼糧中，仔豬腸道大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌的數(shù)量顯著降低。Michiels等（2009）研究表明，百里香酚能夠顯著提高仔豬空腸和盲腸中乳酸桿菌的數(shù)量，降低空腸中的厭氧菌、梭菌和鏈球菌的數(shù)量。植物精油對(duì)細(xì)菌的抑制作用具有廣譜性，既能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，又能抑制革蘭氏陰性菌。產(chǎn)氣莢膜梭菌是一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌，可產(chǎn)生芽孢，是臨床上氣性壞疽病原菌中最多見(jiàn)的一種梭菌。Ouwehand等（2010）報(bào)道，致病性的大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和沙門(mén)氏菌可被牛至精油、迷迭香精油、百里香精油以及香芹酚、百里香酚、肉桂醛、檸檬醛和檸檬烯等單品所抑制，而這些物質(zhì)對(duì)腸道有益菌如羅伊氏乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和短雙歧桿菌的抑制作用較弱。

本試驗(yàn)研究香芹酚、天然肉桂醛、丁香酚、合成牛至油、天然牛至油、山蒼子油、百里香酚、合成肉桂醛及智特奇植物精油產(chǎn)品“智然香”等9種植物精油對(duì)腸道致病菌產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌作用，比較其與硫酸粘桿菌素的抑菌效果，旨在研究一種對(duì)致病厭氧菌具有良好抑菌作用的精油抗菌劑。

1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.1 試驗(yàn)材料

市場(chǎng)上出售的不同廠家生產(chǎn)的香芹酚、天然肉桂醛、丁香酚、合成牛至油、天然牛至油、山蒼子油、百里香酚、合成肉桂醛、廣州智特奇生物科技股份有限公司的植物精油產(chǎn)品“智然香”以及硫酸粘桿菌素。產(chǎn)氣莢膜梭菌購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2 試驗(yàn)儀器

厭氧培養(yǎng)箱；恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-CJ-IG型單人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHG-924OA電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；不銹鋼手提式蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；FA2004電子天平(感量0.0001g)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；酒精燈、培養(yǎng)皿、試管、移液槍、接種環(huán)等。

1.3 培養(yǎng)基

胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，葡萄糖 5g，氯化鈉 5g，酵母膏3g，乙酸鈉 3g，可溶性淀粉 1g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，瓊脂15g，加入900mL水溶解，攪拌均勻，用0.1mol/mL的NaOH溶液把pH調(diào)至6.8，再加入蒸餾水至 1000mL，121℃滅菌 20min，冷卻待用。

1.4 培養(yǎng)基的處理

將各植物精油與吐溫-80按體積比1:3配制，加水稀釋配制成10%的植物精油溶液，在厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)將各植物精油溶液與硫酸粘桿菌素加入到滅菌好的培養(yǎng)皿，設(shè)置不同的濃度梯度，然后將滅菌后冷卻至60℃左右的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，平皿內(nèi)溶液終體積為5mL，混合均勻，冷卻凝固。

1.5 菌懸液的配制

在厭氧環(huán)境中，從經(jīng)過(guò)活化的菌平板中挑取一定量的菌落至滅菌生理鹽水中，混合均勻，配成菌懸液，4℃保存待用。

1.6 菌液接種

分別在對(duì)應(yīng)的平皿加入25μL產(chǎn)氣莢膜梭菌，利用涂布棒將菌液涂布均勻，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)袋中，充入氮?dú)?，封好口，放入培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48h，觀察菌體的生長(zhǎng)情況，細(xì)菌生長(zhǎng)完全被抑制時(shí)所對(duì)應(yīng)最低藥物濃度即為MIC。

2 數(shù)據(jù)與分析

不同植物精油對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的最低抑菌濃度如下表所示。由表可知，與硫酸黏桿菌素相比，各植物精油對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌均有較好的抑菌效果。9種精油對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌效果由強(qiáng)到弱排序?yàn)椋汉铣扇夤鹑?.004%）＞香芹酚（0.02%）=百里香酚（0.02%）=天然肉桂醛（0.02%）=智然香（0.02%）＞合成牛至油（0.05%）＞丁香酚（0.07%）＞天然牛至油（0.08%）＞山蒼子油（0.11%）。

表1 不同植物精油對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的最低抑菌濃度

3 討論

植物精油主要來(lái)自植物的花、葉、根、樹(shù)皮、果實(shí)、種子和樹(shù)脂等，一般含有酚類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)和萜烯類(lèi)化合物等主要成分。酚類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)和萜烯類(lèi)化合物有一定的抑菌作用，其作用機(jī)理可能為：第一，多數(shù)植物精油的主要成分是酚類(lèi)及萜類(lèi)化合物，萜類(lèi)化合物有著較強(qiáng)的抗菌作用，其能使細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)蛋白變性和凝聚，改變H+和K+的滲透性，會(huì)使細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換失去平衡，細(xì)胞內(nèi)容物滲漏，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡（蔡一鳴等，1995；林清華等，1997）；第二，會(huì)改變線粒體膜的通透性，阻止線粒體的呼吸氧化過(guò)程，使病原微生物因缺乏能量供應(yīng)而死亡（陳權(quán)軍等，2004）；第三，進(jìn)入病原體的核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，進(jìn)而影響膜的通透性，使蛋白質(zhì)、酶的合成和轉(zhuǎn)換受阻，從而影響病原微生物的生長(zhǎng)（楊頻等，2004）；第四，直接影響脂質(zhì)層的穩(wěn)定性，溶解病原微生物的脂肪體，甚至?xí)档图?xì)胞膜脂質(zhì)層的相變溫度，進(jìn)而影響脂膜的流動(dòng)性（Martin等，1988）。研究表明在植物精油中，百里香酚和肉桂醛屬于抑菌活性最強(qiáng)的成分，二者均能作用于細(xì)菌細(xì)胞膜上的靶點(diǎn)。王改琴等（2014）采用瓊脂平板孔洞法分別對(duì)不同來(lái)源的肉桂醛、香芹酚等植物精油及其混合物進(jìn)行體外抑菌效果篩選和評(píng)估，結(jié)果表明肉桂醛的抑菌效果最好。李文茹等（2013）研究了肉桂、山蒼子、丁香、香茅、迷迭香和大蒜精油等6種典型植物精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性，結(jié)果表明肉桂的抑菌效果最好。Macheboeuf等（2008）結(jié)果表明，肉桂醛是醛類(lèi)揮發(fā)油中抑菌效果最好的活性物質(zhì)。

產(chǎn)氣莢膜梭菌又稱(chēng)魏氏梭菌，為厭氧性的革蘭陽(yáng)性菌，在某些條件下，可能成為人獸共患病病原菌，導(dǎo)致壞死性腸炎、腸毒血癥和創(chuàng)傷性氣性壞疽等疾病。目前，防治產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的疾病主要是使用抗生素及化學(xué)合成藥物，然而大量使用抗生素導(dǎo)致耐藥性菌株不斷出現(xiàn)，以致疾病難以控制，同時(shí)長(zhǎng)期使用這類(lèi)藥物會(huì)污染自然環(huán)境、傷害機(jī)體、降低免疫力。所以，人們?cè)诓粩鄬ふ铱股睾突瘜W(xué)藥物的替代品。植物精油屬天然產(chǎn)物，有低殘留、低毒副作用、無(wú)污染等特點(diǎn)，其殺菌、保健等功能越來(lái)越引起人們的關(guān)注，從中篩選出抗生素及化學(xué)合成藥的新型替代物是解決抗生素濫用問(wèn)題的有效途徑之一。研究發(fā)現(xiàn)，在仔豬（LiSY等，2012）和雞（Jamroz等，2005）飼糧中添加適宜水平的百里香酚和肉桂醛等提高了腸道乳酸桿菌的數(shù)量，降低了大腸桿菌數(shù)量；牛至和大蒜精油降低了肉雞腸道梭狀芽孢桿菌和鏈球菌數(shù)量（Kirkpinar等，2011）。以上結(jié)果表明，植物精油能抑制有害菌生長(zhǎng)，改善腸道菌群平衡，從而保證其消化吸收能力的發(fā)揮。Ouwehand等（2010）報(bào)道，致病性的大腸桿菌、產(chǎn)氣夾膜梭菌和沙門(mén)氏菌可被牛至精油、迷迭香精油、百里香精油以及香芹酚、百里香酚、肉桂醛、檸檬醛和檸檬烯等單品所抑制。杜恩存（2016）采用肉湯法通過(guò)體外試驗(yàn)研究了百里香酚和香芹酚對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)百里香酚和香芹酚對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌具有相同的抑菌效果，MIC均為 375μg/mL。韓乾杰等（2017）采用牛津杯法，測(cè)定肉桂醛、百里香酚和香蘭素對(duì)于4種細(xì)菌（大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、乳酸菌）的抑菌效果，結(jié)果表明3種植物精油均對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌有明顯抑制作用，但對(duì)乳酸菌無(wú)抑制作用，在相同濃度下，抑菌效果為肉桂醛＞香蘭素＞百里香酚。張皓然等（2018）研究了植物精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌的抑菌效果，結(jié)果表明植物精油中肉桂醛的抑菌作用優(yōu)于百里香酚和香蘭素。

本試驗(yàn)用瓊脂平板法研究了香芹酚、天然肉桂醛、丁香酚、合成牛至油、天然牛至油、山蒼子油、百里香酚、合成肉桂醛、智特奇植物精油產(chǎn)品智然香等9種植物精油對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9種精油均對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌有較好的抑菌效果，且不同植物精油的抑菌效果不同，其中合成肉桂醛對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌效果最好，MIC為0.004%，抑菌效果明顯優(yōu)于其他精油。對(duì)于常見(jiàn)的植物精油組分百里香酚和香芹酚，有研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC分別為0.24mg/mL和0.30mg/mL（杜恩存，2016），本試驗(yàn)中百里香酚和香芹酚對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC均為0.02%，百里香酚的MIC與前人研究相符合，香芹酚的MIC優(yōu)于前人的研究結(jié)果。從本試驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)合成的植物精油效果好于天然的植物精油，另外智特奇植物精油產(chǎn)品智然香對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌有較好的抑菌效果，其MIC為0.02%，抑菌效果好于牛至油、丁香酚和山蒼子油。

4 結(jié)論

9種植物精油對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌有較好的抑菌效果，抑菌效果均好于硫酸粘桿菌，合成肉桂醛的抑菌效果最好，其次是百里香酚、天然肉桂醛、香芹酚及智然香，合成牛至油、天然牛至油、丁香酚對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的最低抑菌濃度相對(duì)較高，而山蒼子油的抑菌效果最差。