綠色木霉B3菌株發(fā)酵液殺線活性分析及其穩(wěn)定性測(cè)定

李 通,毛維興,薛應(yīng)鈺，張樹武，徐秉良

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070)

小麥禾谷孢囊線蟲(Heteroderaavenae) 屬于植物寄生線蟲，自1908年在英國(guó)首次發(fā)現(xiàn)以來，近年已在32個(gè)國(guó)家發(fā)生并引發(fā)危害[1]，如在澳大利亞小麥?zhǔn)芎γ娣e達(dá)2×106hm2，導(dǎo)致減產(chǎn)23%～50%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)73%～89%，每年造成經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)7000萬(wàn)美元[2]。自1989年在中國(guó)湖北天門山首次發(fā)現(xiàn)小麥禾谷孢囊線蟲以來，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)該線蟲廣泛分布于河北、河南、北京、湖北、甘肅、青海和安徽等省(市)，危害面積超過百萬(wàn)公頃，已成為小麥生產(chǎn)的一個(gè)新問題[3-5]。目前，關(guān)于植物寄生蟲的防治主要采用化學(xué)藥劑和種植抗病品種，雖然化學(xué)藥劑殺線活性高，但對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重、毒性大、殘留高且很難降解，進(jìn)而嚴(yán)重影響人畜健康和有益生物的安全[6]。同時(shí)，大多數(shù)抗病品種作物在同一區(qū)域連作以后，抗性也會(huì)逐漸減弱[7]。因此，微生物防治植物病原線蟲已成為目前研究的新趨勢(shì)和新方向[8]。

木霉屬真菌(Trichodermaspp.) 作為土壤微生物的主要組成群落之一[9-10]，也是海洋中普遍存在的一類真菌[11-12]。中國(guó)物產(chǎn)豐富，地理環(huán)境和氣候差異多樣，木霉菌種類繁多，目前國(guó)內(nèi)已報(bào)道的有25種[13-14]。木霉菌具有較強(qiáng)廣譜性、廣泛適應(yīng)性和多種拮抗機(jī)制等特點(diǎn)，已被作為一類重要的生防菌應(yīng)用于植物病害的生物防治，但相關(guān)報(bào)道表明其在田間防治中受到多種環(huán)境因素的影響(如溫度、濕度、土壤質(zhì)地、結(jié)構(gòu)和線蟲數(shù)量等)。筆者從前期分離保存的120株木霉菌中篩選獲得一株生長(zhǎng)速率快、產(chǎn)孢量和殺線活性強(qiáng)的綠色木霉B3菌株，但目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)綠色木霉B3菌株對(duì)禾谷孢囊線蟲毒殺活性及穩(wěn)定性方面尚未報(bào)道和研究。因此，本試驗(yàn)通過綠色木霉B3菌株發(fā)酵液對(duì)禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲毒殺活性及其穩(wěn)定性的測(cè)定，以便為植物寄生線蟲生防制劑的開發(fā)和利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株 綠色木霉(T.viride) B3菌株。由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 供試線蟲 禾谷孢囊線蟲(H.avenae) 2齡幼蟲，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 綠色木霉B3菌株孢子懸浮液與發(fā)酵液制備 向在PDA平板上活化培養(yǎng)6 d的綠色木霉中加入1滴吐溫-80(Tween-80) 和5 mL無(wú)菌水充分振蕩，并使其分生孢子脫落在無(wú)菌水中，即得到分生孢子懸浮液的原液，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)原液的濃度使其為1.0×107個(gè)/mL，備用。然后，將PDB液體培養(yǎng)基分裝于150 mL三角瓶中，每個(gè)三角瓶分裝60 mL培養(yǎng)基，并分別加入 1 mL分生孢子懸浮液，以加入1 mL無(wú)菌水和1滴Tween-80作為對(duì)照，每個(gè)處理和對(duì)照重復(fù)3次，并置于25 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min和16 h/8 h光照的控溫振蕩器中連續(xù)培養(yǎng)7 d。7 d后，將其通過雙層濾膜過濾即得到發(fā)酵液的原液，并保存于 4 ℃冰箱，備用。

1.2.2 綠色木霉B3菌株殺線活性及其穩(wěn)定性測(cè)定 微波處理穩(wěn)定性測(cè)定:將綠色木霉B3菌株發(fā)酵液10 mL置于150 mL三角瓶?jī)?nèi)，并置于微波爐中(功率800 W)分別處理 10、30、60、120和300 s，待自然冷卻后進(jìn)行殺線活性測(cè)定。殺線活性測(cè)定參照張樹武等[15]方法。將分離的禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲配制成懸浮液，濃度為3～4條/10 μL，保存在50 mL離心管中，備用。然后，利用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行殺線活性測(cè)定，每孔取10 μL線蟲懸浮液，然后加入90 μL不同條件下處理的發(fā)酵液，每個(gè)處理組和對(duì)照組25 ℃處理線蟲24、48和72 h時(shí)，分別觀察并記錄線蟲的死亡率。試驗(yàn)過程中每個(gè)處理和對(duì)照均重復(fù)6次。殺線活性測(cè)定方法下同。

線蟲死亡率=(死亡線蟲數(shù)/供試總線蟲 數(shù))×100%

光照穩(wěn)定性測(cè)定:將綠色木霉B3菌株發(fā)酵液20 mL加入不加皿蓋的培養(yǎng)皿(d=9 cm) 中，置于照度為4 000 lx可見光的培養(yǎng)箱中分別照射0 h、6 h、18 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h和120 h后進(jìn)行殺線活性測(cè)定。試驗(yàn)過程中每個(gè)處理和對(duì)照均重復(fù)6次。

金屬離子穩(wěn)定性測(cè)定:利用經(jīng)滅菌處理的ddH2O分別配制濃度為0.1 mol/L的K+、Cu2+、Mg2+、Fe3+、Na+、Fe2+和Zn2+的離子溶液，與無(wú)菌發(fā)酵液按1∶9體積比混合，4 ℃下放置24 h后進(jìn)行殺線活性測(cè)定。試驗(yàn)過程中以未處理的發(fā)酵液作為對(duì)照，且每個(gè)處理和對(duì)照均重復(fù)6次。

耐儲(chǔ)藏性測(cè)定:將綠色木霉B3菌株發(fā)酵液各50 mL裝入無(wú)菌的密封三角瓶中，于4 ℃和室溫下分別儲(chǔ)藏10～60 d后進(jìn)行殺線活性測(cè)定。試驗(yàn)過程中以未處理的發(fā)酵液作為對(duì)照，每個(gè)處理和對(duì)照均重復(fù)6次。

酸堿穩(wěn)定性測(cè)定:將綠色木霉B3菌株發(fā)酵液各25 mL于三角瓶(規(guī)格50 mL) 中，經(jīng)1 mol/L 鹽酸和1 mol/L氫氧化鈉分別調(diào)整pH至2～12，并于4 ℃冰箱靜置24 h后將各處理pH調(diào)回發(fā)酵液原始pH進(jìn)行殺線活性測(cè)定。試驗(yàn)以未經(jīng)1 mol/L 鹽酸和1 mol/L氫氧化鈉處理的綠色木霉B3菌株發(fā)酵液作為對(duì)照，每個(gè)處理和對(duì)照均重復(fù)6次。

氧化還原穩(wěn)定性:利用經(jīng)滅菌的ddH2O分別配制不同濃度的雙氧水與亞硫酸鈉。將氧化劑雙氧水配制為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9和1.1 mol/L 6個(gè)濃度梯度，還原劑亞硫酸鈉配制為 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9和1.1 mol/L 6個(gè)濃度梯度。然后，將各處理濃度的氧化還原劑與發(fā)酵液按1∶9體積比混合，4 ℃下放置24 h后進(jìn)行殺線活性測(cè)定。試驗(yàn)過程中以未處理的發(fā)酵液作為對(duì)照，且每個(gè)處理和對(duì)照均重復(fù)6次。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2007整理，采用 SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析并做差異顯著性檢驗(yàn)(Duncan氏新復(fù)極差法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波處理對(duì)綠色木霉B3菌株殺線活性及其穩(wěn)定性影響

隨著綠色木霉B3菌株發(fā)酵液處理線蟲時(shí)間的增加，其發(fā)酵液對(duì)禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲的毒殺活性隨著處理時(shí)間的增加而增強(qiáng)，尤其處理 72 h時(shí)，2齡幼蟲死亡率最高為86.82%。同時(shí)，綠色木霉B3菌株發(fā)酵液經(jīng)微波處理后，其殺線活性與未處理對(duì)照菌株發(fā)酵液相比整體無(wú)顯著差異。處理禾谷孢囊線蟲24 h后，經(jīng)微波處理的發(fā)酵液其殺線活性顯著高于未處理菌株發(fā)酵液，尤其微波處理時(shí)間為2.0 min時(shí)，其殺線活性最高；處理線蟲48和72 h后，經(jīng)微波處理發(fā)酵液與未處理菌株發(fā)酵液殺線活性無(wú)顯著差異(圖1)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同 Different letters mean significantly differences(P<0.05)，The same below.

2.2 光照穩(wěn)定性

研究結(jié)果表明，綠色木霉B3發(fā)酵液經(jīng)不同時(shí)間段光照處理后，對(duì)禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲的毒殺活性與對(duì)照相比無(wú)顯著差異。處理線蟲 72 h時(shí)，當(dāng)光照處理時(shí)間為6～56 h時(shí)，2齡幼蟲死亡率均大于80%，尤其發(fā)酵液光照處理48 h時(shí)，其殺線活性顯著高于未處理菌株發(fā)酵液，但是隨著處理時(shí)間的增加，當(dāng)發(fā)酵液光照處理時(shí)間為56～96 h時(shí)，其殺線活性為71.4%～76.91%，與未處理發(fā)酵液無(wú)顯著差異；當(dāng)發(fā)酵液光照處理時(shí)間為120 h時(shí)，其殺線活性顯著降低(圖2)。

圖2 光照處理后綠色木霉B3菌株殺線活性及其穩(wěn)定性Fig.2 Nematicidal activity and stability in vitro of Trichoderma viride B3 strain after light treatment

2.3 金屬離子穩(wěn)定性

綠色木霉B3發(fā)酵液經(jīng)不同金屬離子處理后，再處理線蟲24 h，Ca2+處理的發(fā)酵液殺線活性顯著高于未處理發(fā)酵液；處理線蟲48 h后發(fā)現(xiàn)Zn2+和Fe3+對(duì)線蟲的毒殺作用略高于未處理的發(fā)酵液；處理線蟲72 h后發(fā)現(xiàn)K+和Mg2+對(duì)發(fā)酵液的殺線效果影響較大，與對(duì)照相比線蟲死亡率分別降低29%和10%，但是Zn2+和Fe3+對(duì)菌株發(fā)酵液殺線活性無(wú)顯著影響，表明其穩(wěn)定性較好(圖3)。

2.4 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

綠色木霉B3菌株發(fā)酵液在25 ℃下儲(chǔ)藏0～40 d后，與對(duì)照相比，其發(fā)酵液在處理線蟲24和48 h后殺線活性無(wú)顯著變化，但在儲(chǔ)藏50和 60 d后，處理線蟲24和48 h其殺線活性顯著降低。然而，其發(fā)酵液在儲(chǔ)藏0～60 d后，發(fā)酵液處理線蟲72 h時(shí)，其殺線活性與對(duì)照相比均無(wú)顯著差異(圖4)。

2.5 酸堿穩(wěn)定性

結(jié)果表明，不同pH對(duì)綠色木霉B3菌株發(fā)酵液殺線活性具有不同程度的影響，尤其在pH=2和pH=12條件下，其發(fā)酵液處理線蟲24 h后，殺線活性與對(duì)照(pH 7.6)相比差異顯著，但是在pH為 4～10條件下，其發(fā)酵液處理線蟲72 h后，殺線活性與對(duì)照相比無(wú)顯著差異。當(dāng)pH為12時(shí)，殺線活性略低于對(duì)照(pH 7.6)，但差異較少(圖5)。

圖3 金屬離子處理后綠色木霉B3菌株殺線活性及其穩(wěn)定性Fig.3 Nematicidal activity and stability in vitro of Trichoderma viride B3 strain after metal ion treatment

圖4 貯藏一定時(shí)間后綠色木霉B3菌株殺線活性及其穩(wěn)定性Fig.4 Nematicidal activity and stability in vitro of Trichoderma viride B3 strain for a certain period of time

圖5 不同pH綠色木霉B3菌株殺線活性及其穩(wěn)定性Fig.5 Nematicidal activity and stability in vitro of Trichoderma viride B3 strain with different pH

2.6 氧化還原穩(wěn)定性

研究結(jié)果表明，不同濃度氧化劑H2O2對(duì)綠色木霉B3菌株發(fā)酵液殺線活性具有不同程度的影響，當(dāng)綠色木霉B3菌株發(fā)酵液經(jīng)0.9 mol/L H2O2處理后，其殺線活性顯著降低，尤其處理線蟲 72 h，線蟲的死亡率為66.7%，與對(duì)照相比降低16.3%。然而當(dāng)雙氧水為0.3 mol/L時(shí)，處理線蟲 72 h，線蟲死亡率高達(dá)90%，與未處理的發(fā)酵液相比線蟲死亡率增加7%，顯著提高B3菌株的殺線活性(圖6)。

不同濃度還原劑Na2SO3對(duì)綠色木霉B3菌株發(fā)酵液殺線活性具有不同程度的影響，當(dāng)還原劑Na2SO3濃度為1.1 mol/L時(shí)，處理線蟲72 h，殺線活性顯著降低。然而，當(dāng)還原劑濃度為 0.9～0.1 mol/L時(shí)，殺線活性與未處理相比無(wú)顯著變化(圖7)。

圖6 氧化劑(雙氧水)處理后綠色木霉B3殺線活性及其穩(wěn)定性Fig.6 Nematicidal activity and stability in vitro of Trichoderma viride B3 strain treated with oxidant(hydrogen peroxide)

圖7 還原劑(亞硫酸鈉)處理后綠色木霉B3殺線活性及其穩(wěn)定性Fig.7 Nematicidal activity and stability in vitro of Trichoderma viride B3 strain treated with reducing agent(sodium sulfite)

3 結(jié)論與討論

綠色木霉(T.viride) 是自然界中廣泛分布的一種土傳植物病害拮抗生防菌，其在植物病害生物防治中具有重要意義。劉萬(wàn)斌[16]研究表明，綠色木霉HS-4對(duì)引起向日葵枯萎病的鐮刀菌(Fusariumspp.) 具有良好的抑制作用，其抑菌率為81.46%；安霞[17]研究發(fā)現(xiàn)，綠色木霉TV41對(duì)辣椒疫病的盆栽防治效果可達(dá)82.33%；Gajera等[18]發(fā)現(xiàn)，綠色木霉JAU60可以將黑曲霉(Aspergillusniger) 引起的落花生環(huán)腐病發(fā)生率降低51%～58%；Al-Hazmi等[19]研究發(fā)現(xiàn)，綠色木霉和哈茨木霉(T.harzianum)對(duì)番茄爪哇根結(jié)線蟲(Meloidogynejavanica) 的繁殖和根結(jié)的增長(zhǎng)有良好的抑制作用，且能夠促進(jìn)番茄幼苗的生長(zhǎng)，但是目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)綠色木霉對(duì)植物病原線蟲的毒殺作用報(bào)道較少。

本試驗(yàn)通過測(cè)定微波、光照、金屬離子、儲(chǔ)藏時(shí)間、酸堿、氧化和還原劑等因素對(duì)綠色木霉B3菌株殺線活性及其穩(wěn)定性的影響，表明綠色木霉B3對(duì)禾谷胞囊線蟲具有較強(qiáng)的毒殺活性，且微波、光照、金屬離子和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)其殺線活性無(wú)顯著影響，能夠保持良好的穩(wěn)定性。另外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高酸性和高堿條件對(duì)綠色木霉B3菌株發(fā)酵液殺線活性具有顯著影響，可能是發(fā)酵液中的殺線活性物質(zhì)在高酸和高堿的條件下發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致其對(duì)線蟲的毒殺作用降低。同時(shí)，不同濃度的氧化和還原劑不僅對(duì)綠色木霉B3菌株發(fā)酵液殺線的穩(wěn)定性無(wú)顯著影響，而且能夠提高綠色木霉菌株B3發(fā)酵液的殺線活性。褚福紅等[20]測(cè)定綠色木霉代謝物對(duì)芒果炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)抑菌率的穩(wěn)定性，抑菌率達(dá)到74.18%，對(duì)熱、光、微波較為穩(wěn)定，在pH 6～7時(shí)亦較為穩(wěn)定，與本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)綠色木霉B3菌株發(fā)酵液在pH 2～10時(shí)殺線活性均穩(wěn)定的結(jié)論有所不同。張?chǎng)埖萚21]發(fā)現(xiàn)鏈霉菌(Streptomycetaceae) S417發(fā)酵液對(duì)玉米大斑病菌(Helminthosporiumturcicum) 和香蕉炭疽病菌(Gloeosporiummusarum) 等5種病原菌的抑菌率為82.5%～69.6%，在堿性條件下發(fā)酵液的穩(wěn)定性降低，Cu2+、Fe3+對(duì)代謝產(chǎn)物的影響較大，而本試驗(yàn)中綠色木霉菌株B3在pH 2～12條件下均穩(wěn)定，且防腐劑、氧化劑、還原劑對(duì)其影響不顯著。本試驗(yàn)表明Zn2+和Fe3+對(duì)綠色木霉菌株B3具有良好的穩(wěn)定性，這可能與不同菌株的生物學(xué)特性和微生物的種類等有關(guān)。張建華等[22]發(fā)現(xiàn)，高溫、酸堿、自然光和紫外光處理對(duì)長(zhǎng)枝木霉T6菌株發(fā)酵液抑菌活性無(wú)顯著影響，在4 ℃和常溫下儲(chǔ)存60 d其抑菌活性保持不變。這與本研究結(jié)果相符合。伊洪偉[23]研究表明，酸堿條件對(duì)長(zhǎng)枝木霉發(fā)酵液抑菌活性影響較大，這與本試驗(yàn)的結(jié)果亦相符合。

本研究表明，自然光和微波處理對(duì)綠色木霉菌株B3發(fā)酵液殺線活性無(wú)顯著影響，該發(fā)酵液抗氧化性、還原性和耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿性較強(qiáng)，耐貯藏性也較好。然而有關(guān)綠色木霉菌株B3發(fā)酵液殺線代謝產(chǎn)物的種類和結(jié)構(gòu)尚待進(jìn)一步研究。