微波法高效制備固定化胰蛋白酶

劉偉華， 姜子濤， 李 榮

（天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院/天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134）

胰蛋白酶是一種肽鏈內(nèi)切酶，能水解由賴(lài)氨酸和精氨酸的羧基參與形成的肽鏈，被廣泛地應(yīng)用于輕工業(yè)及醫(yī)療行業(yè)。然而游離的胰蛋白酶穩(wěn)定性較差，因此對(duì)游離的胰蛋白酶進(jìn)行修飾，如采用固定化等方法來(lái)延長(zhǎng)其使用壽命是十分必要的。

樹(shù)脂是一類(lèi)多聚物，具有一定的孔徑和-COOH、-OH、≡N等功能基團(tuán)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，機(jī)械性能良好，可以作為固定化酶的載體[1-12]。

微波能使極性分子發(fā)生自旋運(yùn)動(dòng)而被加熱，微波能提高反應(yīng)的效率及產(chǎn)率。如微波提取[13]、微波合成[14]、微波酶解[15]、微波輔助固定化微生物[16]，微波固定化肝素[17]以及微波固定化酶[18-25]等。值得一提的是，采用微波輔助制備的固定化酶穩(wěn)定性較好，甚至酶活力也有所提高?？梢?jiàn)，采用微波來(lái)制備固定化酶是可行的。

因此，通過(guò)從9種樹(shù)脂中篩選出效果較好的D151樹(shù)脂作為固定化胰蛋白酶的載體，采用吸附-微波輔助交聯(lián)法，制備固定化胰蛋白酶。選用中心組合設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法（CCD-RSM）優(yōu)化制備固定化胰蛋白酶的工藝，并對(duì)固定化胰蛋白酶的性質(zhì)及應(yīng)用做了相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胰蛋白酶：上海阿拉丁生物科技股份有限公司產(chǎn)品；戊二醛和乙腈（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品； 樹(shù)脂（D3520、D4020、H103、NKA-9、D301R、D380、D280、D061、D151）： 天津南開(kāi)合成科技有限公司產(chǎn)品；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Multi SYNTH微波合成儀：意大利Milestone公司產(chǎn)品；Alpha-1500紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海譜元儀器有限公司產(chǎn)品；WE-1水浴恒溫振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司產(chǎn)品；1260高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；色譜柱Vydac-C18（250 mm×4.6 m，5 μm）：Grace公司產(chǎn)品；DK-S12 電熱恒溫水浴鍋：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微波輔助固定化胰蛋白酶 準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g樹(shù)脂，加入用緩沖溶液配制的胰蛋白酶溶液5 mL，在水浴恒溫振蕩器中吸附一定時(shí)間，然后加入一定濃度的戊二醛置于微波合成儀中，微波輔助交聯(lián)胰蛋白酶。交聯(lián)完成后用蒸餾水將殘留的戊二醛清洗干凈。

1.3.2 酶活力的測(cè)定 采用福林酚法[18]。在40℃、pH 8.0的條件下，1 min內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位，以U表示。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g樹(shù)脂，分別改變吸附時(shí)間、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加酶量、pH、交聯(lián)時(shí)間及交聯(lián)溫度等因素，制備固定化酶，并測(cè)定制備的固定化酶的活力。

1.3.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)方差分析選取主要的影響因素并選用CCDRSM設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，響應(yīng)面的因素編碼及變量水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面因素編碼及水平Table1 Factors and levels of response surface design

1.3.5 固定化胰蛋白酶性質(zhì)的研究

1）溫度穩(wěn)定性 將固定化胰蛋白酶分別在25、35、45、55、65℃不同溫度的水浴中放置3 h后測(cè)定其酶活力。

2）酸堿穩(wěn)定性 將固定化胰蛋白酶分別置于pH為4～10的緩沖液中在室溫下放置3 h后測(cè)定固定化酶的活力。

3）重復(fù)使用性 按照1.3.2的方法，重復(fù)使用固定化胰蛋白酶，同時(shí)測(cè)定酶活力。每使用完一次將固定化酶分別用蒸餾水和緩沖液清洗干凈，并將其置于新的底物中繼續(xù)反應(yīng)。

4）儲(chǔ)藏穩(wěn)定性 將固定化胰蛋白酶置于4℃冰箱密封保存，每一周測(cè)定固定化酶的活力。

1.3.6 固定化胰蛋白酶的應(yīng)用 為了進(jìn)一步比較固定化胰蛋白酶與游離胰蛋白酶在應(yīng)用方面的差異，在50℃、固定化胰蛋白酶及游離胰蛋白酶各自適宜的pH條件下，水解底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的酪蛋白溶液，然后將水解液分別冷凍干燥。之后用HPLC對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行分析。色譜條件為流動(dòng)相：超純水（A），乙腈（B）；洗脫條件：0～5 min，體積分?jǐn)?shù) 3%B；5～10 min， 體積分?jǐn)?shù) 6%B；10～15 min， 體積分?jǐn)?shù)10%B；15～25 min，體積分?jǐn)?shù) 40%B。 流量：1 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm。

1.3.7 水解度的測(cè)定 選用pH-State法，測(cè)定酪蛋白水解產(chǎn)物的水解度（DH），其公式為

式中，B為堿液體積 （mL）；Nb為堿液的摩爾濃度（mol/L）；α 為 α-氨基的離解常數(shù)；Mp為酷蛋白的質(zhì)量（mg）；Htot為每克酪蛋白中肽鍵的毫摩爾數(shù)（mmol/g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹(shù)脂載體的選擇

向各樹(shù)脂中加入等量的酶溶液，在恒溫水浴振蕩器中振蕩2 h。通過(guò)測(cè)定上清液中的酶濃度計(jì)算吸附的酶量，并測(cè)定固定化酶的活力，不同樹(shù)脂載體的固定化效果見(jiàn)表2。

表2 不同樹(shù)脂載體的固定化效果Table2 Immobilization results of different resins

由表可知，就吸附酶量來(lái)看，弱極性的大孔陰離子（D380）、大孔陽(yáng)離子（D151）和大孔吸附樹(shù)脂NKA-9效果較好。就單位固定化酶活性來(lái)看，D151的活性最高，而固定化吸附酶量較高的大孔吸附樹(shù)脂（NKA-9）和弱極性的大孔陰離子（D380）固定化后酶活力卻很低，這可能由于雖然大孔吸附樹(shù)脂比表面積大、吸附能力強(qiáng)，由于過(guò)強(qiáng)的吸附可能使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生變化導(dǎo)致酶的失活[26]；或者由于固定化后，空間位阻會(huì)直接影響到活性中心對(duì)底物的定位作用。綜合單位固定化酶活性及固定化率兩個(gè)指標(biāo)，D151可作為固定化胰蛋白酶的載體。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

按照1.3.3的方法，研究各單因素條件對(duì)固定化酶活力的影響，以各自最高的酶活力為100%，不同條件下的相對(duì)酶活力結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，D151樹(shù)脂吸附胰蛋白酶1.5 h后固定化酶的活力不再增加，因?yàn)檫^(guò)量吸附的胰蛋白酶致使空間位阻增大，阻礙其與底物的接觸及產(chǎn)物的擴(kuò)散，而使得酶活力下降。戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，制備的固定化酶的活力最高，戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)低時(shí)，交聯(lián)的酶量少，導(dǎo)致固定化酶在沖洗的過(guò)程中部分脫落，酶活低；當(dāng)戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，吸附的酶被過(guò)度交聯(lián)導(dǎo)致酶的空間構(gòu)象被破壞，酶活力降低。隨著加酶量的增大固定化酶的活力逐漸增加，當(dāng)加酶量過(guò)多時(shí)，酶在載體表面的吸附達(dá)到飽和，部分酶會(huì)進(jìn)入載體孔內(nèi)部，無(wú)法與底物作用，加酶量為8.0 mg/mL的時(shí)候酶活力最高。固定化pH為5.0時(shí)酶活力最高，這是因?yàn)橐环矫?，胰蛋白酶的等電點(diǎn)為10.8，在pH 5.0的環(huán)境中，胰蛋白酶帶正電，與載體發(fā)生離子交換吸附，酶吸附的效果好；另一方面，環(huán)境的pH值直接影響酶分子的酸性、堿性氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的解離狀態(tài)，影響酶與底物的親和力。交聯(lián)時(shí)間為3.5 min時(shí)固定化酶活力高。交聯(lián)溫度為30℃時(shí)酶活力高，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致微波的功率過(guò)大，破壞酶的空間結(jié)構(gòu)使酶的活力降低。

圖1 吸附時(shí)間、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加酶量、pH、交聯(lián)時(shí)間及交聯(lián)溫度對(duì)酶活力的影響Fig.1 Effect of adsorption time，glutaraldehyde concentration，dosage of trypsin，pH，crosslinking time and crosslinking temperature on relative activity of immobilized trypsin

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取對(duì)固定化酶的活力影響顯著的3個(gè)因素加酶量、pH、交聯(lián)溫度作為主要的影響因素，采用CCD-RSM設(shè)計(jì)三因素五水平實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 Design and results of response surface design

2.4 二次回歸方程擬合和方差分析

如表4所示，模型的P值＜0.0001，而失擬項(xiàng)P值＞0.05不顯著，說(shuō)明模型是可靠的?；貧w方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果表明，各因素對(duì)固定化酶活力的影響依次為：交聯(lián)溫度＞加酶量＞pH。交聯(lián)溫度是對(duì)回歸模型影響最顯著的因素，很可能是因?yàn)檩^高強(qiáng)度的微波振蕩會(huì)破壞了酶的空間結(jié)構(gòu)[18]。方程的一次項(xiàng)A和B的P值均小于0.01，一次項(xiàng)C的P值＜0.0001，是極顯著的；而交互項(xiàng)AB、AC、BC的P值均大于0.05，是不顯著的。

加酶量、pH及交聯(lián)溫度3個(gè)因素兩兩交互影響固定化酶活力的三維空間曲面圖見(jiàn)圖2。由圖2中曲面線的陡峭和平緩可以直觀地看出各因素對(duì)固定化酶活力的影響程度，曲線越陡峭，則該因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度越大；而等高線的圓心處是極值所對(duì)應(yīng)的條件。

表4 回歸方程的方差分析Table4 Regression equation variance analysis

圖2 兩因素交互作用對(duì)酶活力影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface and contour plots showing the interaction of every two factors on immobilized trypsin activity

去除不顯著的交互項(xiàng)AB、AC、BC，利用Design-Expert 8.0.5對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，以酶活力y為響應(yīng)值，得到對(duì)自變量加酶量A、pHB和交聯(lián)溫度C3個(gè)因素的回歸方程為：y=-2025.8564+114.8252A+310.9090B+68.3877C-7.0426A2-30.7336B2-1.1798C2。調(diào)整后的回歸模型（P＜0.0001）極顯著；該模型R2=0.9945，RAdj2=0.9919，模型與試驗(yàn)擬合程度高，自變量與響應(yīng)值之間的線性關(guān)系顯著，可以用于不同變量條件下的響應(yīng)值預(yù)測(cè)。失擬項(xiàng)P值由0.2648變?yōu)?.2223，因此去掉不顯著的交互項(xiàng)可以使方程的擬合效果更好[27]。

2.5 最優(yōu)條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

調(diào)整后的回歸模型預(yù)測(cè)固定化酶的最佳工藝條件為：加酶量8.15 mg/mL、pH 5.05、交聯(lián)溫度29.00℃，在此條件下酶活力的預(yù)測(cè)值為219.98 U/g?？紤]到實(shí)驗(yàn)的可操作性，修正最佳工藝條件為，加酶量8.2 mg/mL、pH 5.0、微波溫度29.0℃。在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，固定化胰蛋白酶的活力為221.5 U/g樹(shù)脂，相對(duì)誤差為0.69%，與預(yù)測(cè)值接近。

2.6 固定化酶的性質(zhì)

2.6.1 溫度穩(wěn)定性 測(cè)定固定化胰蛋白酶在不同溫度時(shí)的酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖3。

固定化酶在25～45℃的溫度范圍內(nèi)較穩(wěn)定，在65℃放置3 h后酶活力下降了一半多，其酶活力是35℃的46.5%。這可能是由于酶被固定化后其分子整體運(yùn)動(dòng)受限[28]，抑制了自身構(gòu)象的解折疊，同時(shí)減少了分子間相互作用的機(jī)會(huì)，從而熱穩(wěn)定性增加。

圖3 固定化酶的溫度穩(wěn)定性Fig.3 Temperature stability of immobilized trypsin

2.6.2 酸堿穩(wěn)定性 測(cè)定固定化胰蛋白酶在不同pH時(shí)的酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 固定化胰蛋白酶的酸堿穩(wěn)定性Fig.4 pH stability of immobilized trypsin

固定化酶在pH 5.0左右的酸性條件下及pH 9.0～10.0范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。胰蛋白酶被固定化后其空間結(jié)構(gòu)的改變使其與氫離子的作用與原來(lái)不同，所以固定化酶適合的pH發(fā)生了改變。

2.6.3 重復(fù)使用性 以第一次使用后的酶活力為100%，換算出不同使用次數(shù)后固定化酶的相對(duì)酶活力，結(jié)果如圖5所示。

圖5 固定化胰蛋白酶的重復(fù)使用性Fig.5 Reusability of immobilized trypsin

每次反應(yīng)結(jié)束之后用蒸餾水清洗的固定化酶隨著使用次數(shù)的增加，酶活力迅速下降。每次反應(yīng)結(jié)束后用緩沖溶液清洗的固定化酶具有較好的重復(fù)使用性，酶活力下降遲緩。緩沖液有利于固定化酶活力的保存的結(jié)果表明，固定化酶所處環(huán)境的離子狀態(tài)對(duì)固定化酶空間結(jié)構(gòu)的維持具有重要作用。

2.6.4 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性 測(cè)定儲(chǔ)藏不同時(shí)間后的固定化酶的活力，結(jié)果如圖6所示。

圖6 固定化胰蛋白酶的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性Fig.6 Storage stability of immobilized trypsin

固定化胰蛋白酶儲(chǔ)藏一周后發(fā)生較大幅度的活力下降，第二周的酶活力是初始酶活力的87.3%，隨后幾周酶活力降低較少，儲(chǔ)藏5周后酶活力仍保留了初始酶活力的71.1%。

2.7 固定化胰蛋白酶的應(yīng)用

在50℃、固定化胰蛋白酶在pH 9.0，游離胰蛋白酶在pH 8.0的條件下，酶解底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的酪蛋白溶液。將水解液分別冷凍干燥后進(jìn)行HPLC分析，如圖7所示。

加入相同酶活力的兩種酶水解酪蛋白后，固定化胰蛋白酶水解產(chǎn)物及游離胰蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度分別為14.8%和9.6%。從液相色譜圖中可以看出，固定化胰蛋白酶水解產(chǎn)物與游離胰蛋白酶水解產(chǎn)物總體上差別不大，但在保留時(shí)間為3.2 min（峰 2）、20.1 min（峰 3）及 26.8 min（峰 5）處的峰響應(yīng)值明顯大于游離胰蛋白酶水解產(chǎn)物，且在保留時(shí)間為12.9、16.1、34.5 min處還存在一些游離胰蛋白酶水解產(chǎn)物中沒(méi)有的小峰；而游離胰蛋白酶水解產(chǎn)物在 2.3 min（峰 1）、26.0 min（峰 4）處吸收峰的響應(yīng)值大于固定化胰蛋白酶水解產(chǎn)物。這可能是由于胰蛋白酶被固定化后其與底物的親和力發(fā)生了變化，所以固定化胰蛋白酶水解產(chǎn)物與游離胰蛋白酶水解產(chǎn)物略有不同，不過(guò)在水解度方面明顯優(yōu)于游離胰蛋白酶。

圖7 酪蛋白及其水解產(chǎn)物的液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatograms of casein and its hydrolysates

3 結(jié)語(yǔ)

在微波輔助的條件下，以D151樹(shù)脂為固定化載體制備出固定化胰蛋白酶。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和CCD-RSM優(yōu)化確定了微波輔助固定化胰蛋白酶的最佳條件：吸附時(shí)間1.5 h、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%、加酶量8.2 mg/mL、pH 5.0、交聯(lián)溫度29℃以及交聯(lián)時(shí)間3.5 min。整個(gè)制備過(guò)程大約僅需要2 h，制備的固定化胰蛋白酶的溫度及pH使用范圍較游離酶更廣；使用緩沖液沖洗固定化胰蛋白酶可以重復(fù)使用多次，并能保留大部分的酶活力；儲(chǔ)藏5周后酶活力仍保留了初始酶活力的71.1%。通過(guò)比較固定化胰蛋白酶和游離胰蛋白酶水解酪蛋白的效果，發(fā)現(xiàn)固定化胰蛋白酶水解效率更高且產(chǎn)物種類(lèi)更豐富。

目前，已經(jīng)有研究將醛縮酶[18]、青霉素?；竅20]、漆酶[24]等用來(lái)微波固定化，其結(jié)果表明，在固定化時(shí)間大大減少的同時(shí)能夠保持酶的優(yōu)異的催化性能；而微波固定化的嗜熱菌蛋白酶催化活性甚至有所提高[23]，表明微波固定化酶的方法是可取的。