攀枝花芒果遺傳多樣性的RAPD分析

刁毅

摘要：采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對12個芒果品種進(jìn)行遺傳多樣性研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6條RAPD引物共檢測到36條清晰譜帶，其中多態(tài)性條帶占比為77.78%。芒果在物種水平上遺傳多樣性較高，而在居群水平上遺傳多樣性相對較低;居群間遺傳變異較高，在居群水平上，金白花的遺傳多樣性最高，遺傳分化程度最低;乳芒和馬亞的遺傳多樣性最低，遺傳分化程度最高。聚類分析結(jié)果表明，相似系數(shù)為0.72時，12種芒果品種可分為4個大類群，金白花和鷹嘴芒的遺傳一致度最大，貴妃和鷹嘴芒遺傳一致度最低。

關(guān)鍵詞：芒果;RAPD;分子標(biāo)記;遺傳多樣性

中圖分類號： S667.701 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0035-03

芒果（Mangifera indica L.）起源于東南亞，屬漆樹科（Anacardiaceae）芒果屬（Mangifera），是熱帶、亞熱帶水果之一，在亞洲被譽(yù)為“水果之王”[1-2]。我國是世界上十大芒果生產(chǎn)國之一，芒果種植主要分布在年氣溫較高的海南、臺灣、廣西、廣東、云南、四川、福建等地區(qū)。海南、廣西和云南等地是世界芒果原產(chǎn)地之一，擁有豐富的野生芒果資源[3-5]。四川省芒果主產(chǎn)區(qū)主要分布在攀西干熱河谷地帶，該區(qū)域全年熱量充足，日照時數(shù)長，晝夜溫差大，干濕季明顯，冬春氣溫高，全年基本無霜，芒果花期無梅雨，掛果期風(fēng)量少，是全國少有的適宜種植芒果的地區(qū)[6-7]。本研究以云南、廣西芒果品種作對照，分析攀枝花主栽芒果品種的遺傳多樣性，旨在為攀枝花芒果種質(zhì)資源利用、引種、育種、種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

12份芒果種質(zhì)嫩葉采集后，放入冰盒中，在-20 ℃冰箱保存。12個芒果品種名稱與產(chǎn)地信息見表1。

1.2 DNA提取

DNA提取采用改良十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[8-9]。

1.3 RAPD-PCR擴(kuò)增

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）-PCR擴(kuò)增采用馬艷芝等報(bào)道的方法[10]。

RAPD-PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中，8 μL ddH2O，1 μL DNA模板，1 μL RAPD引物，10 μL 2×Taq PCR Master Mix。RAPD-PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，37 ℃退火40 s，72 ℃復(fù)性110 s，35次循環(huán);72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。

1.4 瓊脂糖凝膠電泳

用50 mL 1×TAE和0.5 g瓊脂糖配制1.0%瓊脂糖凝膠，煮沸并適度冷卻后加入5 μL GoldviewⅠ型核酸染色劑，搖勻后倒膠。120 V電泳30 min后，在凝膠成像系統(tǒng)中掃描成像。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)凝膠電泳條帶的有無計(jì)數(shù)，有帶（顯性）記為1，無帶（陰性）記為0，強(qiáng)帶和弱帶均賦值為1，從而形成RAPD表型原始數(shù)據(jù)矩陣。對RAPD表型原始數(shù)據(jù)矩陣用POPGENE32、AMOVA-PREP1.01、NTSYS2.10e等軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析與聚類分析[11-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及多態(tài)性

從表2可以看出，從30條RAPD引物中篩選出6條譜帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的RAPD引物;用6條RAPD引物對12個不同芒果品種DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測到36個條帶，其中多態(tài)性條帶28條，多態(tài)率為77.78%。

2.2 芒果遺傳多樣性分析

用POPGENE32軟件計(jì)算得到的芒果各品種居群遺傳參數(shù)見表3。在物種水平上，多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）為91.67%，觀察等位基因數(shù)（Na）為1.916 7，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.638 1，Neis基因多樣性指數(shù)（He）為0.355 6，Shannon多樣性指數(shù)（I）為0.520 0;在居群水平上，PPB平均值為27.08%，Na為1.270 8，Ne為1.162 6，He為0.260 5，I為 0.140 8。說明芒果物種水平遺傳多樣性比居群水平高。從表3還可以看出，在居群水平上，金白花居群的PPB、Na、He和I最高，說明其遺傳多樣性最高;乳芒和馬亞居群的PPB、Na、He和I均最低，說明其遺傳多樣性最低。

由表6可知，對居群間遺傳多樣性所占比例（Shannon居群分化系數(shù)）與遺傳分化系數(shù)（Gst=0.736 1）作對比得出，金白花Shannon居群分化系數(shù)最低，低于遺傳分化系數(shù);馬亞和乳芒Shannon居群分化系數(shù)最高，高于遺傳分化系數(shù)，說明金白花居群遺傳分化程度最低，馬亞居群和乳芒居群遺傳分化程度最高。

2.4 遺傳距離與聚類分析

遺傳一致度和遺傳距離可以反映群體間遺傳親緣關(guān)系，12個芒果品種居群間的遺傳距離與遺傳一致度見表7。12個品種居群間的遺傳一致度在0.484 6～0.904 8之間;Neis遺傳距離范圍在0.100 0～0.724 5之間。其中，金白花居群和鷹嘴芒居群的遺傳一致度最大，為0.904 8，遺傳距離最小，為0.100 0;貴妃居群和鷹嘴芒居群遺傳一致度最小，為0.484 6，遺傳距離最大，為0.724 5。

根據(jù)POPGENE32軟件得出的遺傳一致度用NTSYS2.10e軟件進(jìn)行聚類分析。由圖1可知，相似系數(shù)為0.72時，12種芒果品種可分為4個大類群：乳芒和攀育2號為一類群;鷹嘴芒、金白花、椰香、馬亞和熱農(nóng)10號為一類群;吉祿和紅蘋為一類群;熱研16號、貴妃和海頓為一類群。

3 討論

分子標(biāo)記是以生物大分子的多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記、生化標(biāo)記之后發(fā)展起來的新技術(shù)，其操作簡單、快速，不受基因表達(dá)與季節(jié)、環(huán)境條件的影響，被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性檢測、構(gòu)建核心種質(zhì)、種質(zhì)資源鑒定與分類、親緣關(guān)系分析、雜種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建等方面。RAPD技術(shù)是用隨機(jī)引物對DNA未知序列基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的技術(shù)，該技術(shù)具有操作簡單、檢測速度快、靈敏度高，可以不依賴種屬特性和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行的優(yōu)點(diǎn)[16]。

本研究選用8份攀枝花芒果主栽品種，同時用3份云南昆明芒果品種與1份廣西南寧芒果品種作對照，通過RAPD技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，芒果在物種水平上遺傳多樣性參數(shù)均高于居群水平平均值，說明芒果在物種水平上遺傳多樣性高。

遺傳分化系數(shù)（Gst）是衡量群體遺傳分化最常用的指標(biāo)，其數(shù)值表示在總的遺傳變異中群體間變異所占的比例。當(dāng)Gst在0～0.05之間時，表示遺傳分化程度弱;當(dāng)Gst在0.05～0.15之間時，表示遺傳分化程度中等;當(dāng)Gst在0.15～0.25之間時，表示物種遺傳分化程度高;當(dāng)Gst大于0.25時，表示遺傳分化程度很高[17]。在本研究中，Gst=0.736 1，說明芒果居群間的變異占總變異的73.61%，居群內(nèi)變異占總變異的26.39%;Gst大于0.25，說明芒果品種遺傳分化程度很高。

芒果遺傳分化系數(shù)（0.736 1）、AMOVA方差分析的居群分化指數(shù)（0.621 7）與Shannon居群分化系數(shù)（0.729 2）在數(shù)值上略有差異，但所表現(xiàn)的遺傳趨勢基本一致，表明芒果居群間的遺傳變異與遺傳分化大于居群內(nèi)。

聚類分析結(jié)果可以看出，12份芒果品種的遺傳一致度在 0.7～0.9之間，說明這些芒果主栽品種具有豐富的遺傳多樣性;但鷹嘴芒與金白花之間遺傳遺傳一致度約為0.9，說明它們之間的親緣關(guān)系比較接近。對攀枝花芒果主栽品種遺傳多樣性的深入研究，將有助于攀枝花芒果引種、育種、種植的有序開展，從而促進(jìn)攀枝花芒果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔚 紅，雷新濤，臧小平. 芒果無公害生產(chǎn)技術(shù)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：8-10.

[2]黃劍鋒，趙志常，黨志國. 香花芒的性狀描述與評價[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2015，36（8）：1380-1384.

[3]葉 子. 中國芒果生產(chǎn)現(xiàn)狀[J]. 世界熱帶農(nóng)業(yè)信息，2004，3（4）：10-11.

[4]黃麗芳，閆 林，范 睿，等. 芒果實(shí)生資源遺傳多樣性的SSR分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32（10）：1828-1832.

[5]陳華蕊，陳業(yè)淵，尼章光，等. 芒果生物技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，21（12）：90-94.

[6]黃 云，劉 斌，杜 邦，等. 2013年攀枝花芒果凍害調(diào)查報(bào)告[J]. 中國熱帶農(nóng)業(yè)，2014，21（2）：51-54.

[7]伍從銀. 攀枝花芒果產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[8]王家保，王令霞，劉志媛，等. 芒果DNA提取方法比較及ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 生物技術(shù)，2005，15（5）：37-41.

[9]張 宇，黃國弟，唐志鵬，等. 芒果總DNA提取方法比較分析[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究，2014，32（2）：62-65.

[10]馬艷芝，陳桂平. 11份荊芥種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析[J]. 中藥材，2017，40（2）：311-314.

[11]孫曉梅. 利用RAPD標(biāo)記評價百合品種間的遺傳多樣性[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，2005：312-342.

[12]Yeh F C，Yang Y，Boyle T J，et al. POPGENE version 1.32，the user-friendly sharewarefor population genetic analysis[J]. University of Alberta，1999，12（11）：143-165.

[13]Nei M.Genetic distance between populations[J]. American Naturalist，1972，106（949）：283-292.

[14]梅嘉洺，黃小霞. 關(guān)于狼尾草屬牧草遺傳多樣性的RAPD和ISSR分析[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院，2016，26（12）：265-269.

[15]鄧明文. 岷江百合種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[D]. 南京：南京林業(yè)大學(xué)，2008.

[16]趙 英. 分子標(biāo)記在芒果上的應(yīng)用研究[J]. 農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用，2013，148（5）：19-23.

[17]Wright S. The genetical structure of populations[J]. Annals of Eugenics，1951，15（4）：323-354.