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      三葉青藤葉配方顆粒急性毒性試驗

      2019-10-25 03:46:50余文靜洪麗婷劉秀棉熊朝棟黃心平
      福建中醫(yī)藥 2019年5期
      關(guān)鍵詞:青藤藥組臟器

      謝 平 ,余文靜 ,陳 丹 ,洪麗婷 ,劉秀棉 ,熊朝棟 ,黃心平

      (1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122;2.寧化縣益珍農(nóng)業(yè)科技有限公司,福建 三明 365406)

      三葉青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg.)為葡萄科崖爬藤屬,是我國特有的珍稀藥用植物和民間常用藥?!逗D现参镏尽罚?]及《中國植物志》[2]中記載三葉青的葉(或全株)可供藥用?,F(xiàn)代藥理實驗表明,三葉青具有抗腫瘤、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗病毒、保肝以及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用,近年來在抗炎和輔助抗腫瘤方面發(fā)揮積極作用[3-4]。三葉青藤葉配方顆粒是以三葉青藤葉飲片為原料,經(jīng)水煎煮制備而成,既可隨證加減,又具有免煎易服、質(zhì)量可控等優(yōu)點[5]。急性毒性試驗是評價24 h內(nèi)1次或多次給藥后動物表現(xiàn)出的毒性反應(yīng),通過測定半數(shù)致死量觀察動物急性毒性中毒表現(xiàn)[6-9]。為評價三葉青藤葉配方顆粒用藥的安全性,實驗依據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[9],采用最大耐受量(MTD)試驗法,通過最大給藥濃度及最大小鼠灌胃體積給藥,觀察小鼠的急性毒性反應(yīng),初步評價三葉青藤葉配方顆粒的口服用藥安全性,為三葉青藤葉配方顆粒的安全性評價奠定基礎(chǔ)。

      1 儀器與材料

      1.1 動物 SPF級昆明小鼠,雌雄各半,體質(zhì)量21~25 g,購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,實驗動物許可證號:SCXK(滬)2017-0005,飼養(yǎng)環(huán)境溫度(22±2)℃,環(huán)境濕度(55±5)%,保持室內(nèi)自然通風(fēng),自由飲食、飲水。實驗前置于飼養(yǎng)環(huán)境中適應(yīng)7 d。SPF級醫(yī)學(xué)實驗動物環(huán)境設(shè)施由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,使用許可證號SYXK(閩)2014-0005。實驗動物處理方法符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

      1.2 試藥 三葉青藤葉(寧化縣益珍農(nóng)業(yè)科技有限公司提供,福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室范世明高級實驗師鑒定);三葉青藤葉配方顆粒(自制,批號20160416);0.9%氯化鈉注射液(福州海王福藥制藥有限公司,批號60929A45)。

      1.3 儀器 ARA520百分之一電子天平、AR2140萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

      2 實驗方法

      2.1 藥液的配制 稱取三葉青藤葉配方顆粒,加25 mL蒸餾水配制成濃稠混懸液,并以灌胃針測試至可吸取的濃稠度,即得三葉青藤葉配方顆粒的最大給藥濃度藥液(0.76 g/mL)。

      2.2 小鼠急性毒性LD50預(yù)實驗 取昆明小鼠40只,體質(zhì)量21~24 g,雌雄各半,分為2組,實驗前分籠飼養(yǎng)3 d后,給藥前禁食不禁水12 h,灌胃給藥三葉青藤葉配方顆粒藥液1次(30.4 g/kg),連續(xù)觀察7 d,擬找出100%死亡率,進行Dm值的測定。

      2.3 急性毒性最大耐受量法試驗 取昆明小鼠40只,體質(zhì)量22~25 g,雌雄各半,雌雄小鼠分開后,分別隨機分為給藥組和空白組,每組各20只,給藥前禁食不禁水12 h。以40 g/kg蒸餾水灌胃空白組1次,以30.4 g/kg三葉青藤葉配方顆粒藥液灌胃給藥組1次。給藥后密切觀察6 h內(nèi)2組小鼠狀況,連續(xù)觀察14 d,每天1次,觀察記錄小鼠外觀、行為活動、精神狀態(tài)、攝食、飲水、排泄情況、是否有中毒癥狀及死亡情況,同時稱量給藥前和給藥后第1、2、3、4、5、7、9、11、14 天體質(zhì)量,記錄體質(zhì)量變化。若有小鼠死亡,立刻將死亡小鼠解剖,肉眼觀察小鼠心、肝、脾、肺、腎等臟器。第14天處死各組小鼠,對其主要臟器進行肉眼觀察比較,若發(fā)現(xiàn)肉眼可見病變,則進行病理組織形態(tài)學(xué)檢查,同時稱取各臟器濕重,計算臟器指數(shù)。

      2.4 檢測指標(biāo) 計算2組小鼠給藥后14 d內(nèi)累計死亡數(shù);記錄給藥組小鼠急性毒性反應(yīng)(皮毛、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)等系統(tǒng)反應(yīng)癥狀及自發(fā)活動變化癥狀);2組小鼠體質(zhì)量變化;2組小鼠臟器指數(shù)變化。

      2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。計量資料符合正態(tài)分布以()表示,采用t檢驗。

      3 結(jié) 果

      3.1 2組小鼠急性毒性LD50預(yù)實驗 結(jié)果表明,2組小鼠狀況良好,無死亡,無法測出LD50,故選擇最大耐受量(MTD)法實驗。

      3.2 給藥組小鼠給藥后癥狀觀察 實驗結(jié)果表明,給藥后10~15 min,給藥組小鼠行動減緩,對外界刺激反應(yīng)遲鈍;25~30 min后,開始逐漸恢復(fù)正常活動及飲食飲水,在鼠籠內(nèi)攀爬,觀察期內(nèi)無動物死亡,2組小鼠均未出現(xiàn)其他急性毒性反應(yīng)癥狀。小鼠急性毒性反應(yīng)癥狀譜,見表1。

      表1 小鼠急性毒性反應(yīng)癥狀譜

      3.3 小鼠急性毒性MTD值測定 根據(jù)三葉青藤葉配方顆粒的小鼠灌胃給藥量,且最大耐受量(MTD)法實驗過程中,2組均未出現(xiàn)小鼠死亡情況。因此,最大耐受劑量大于最大給藥量 30.4 g/(kg·d)(0.76 g/mL×0.4 mL/10 g×1 次),根據(jù)三葉青成人民間服用量15 g/d計算,相當(dāng)于是臨床按60 kg體重計算每公斤體質(zhì)量日用量的121.6倍以上。

      3.4 2組小鼠給藥后第14天臟器指數(shù)比較 給藥后第14天,脫頸處死2組小鼠,解剖,肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎,稱取各臟器濕重,計算臟器指數(shù)。實驗結(jié)果表明,與空白組比較,給藥組的小鼠各臟器的顏色、質(zhì)地?zé)o明顯差異,臟器指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)果見表 2。

      表2 2組小鼠給藥后第14天臟器指數(shù)比較()

      表2 2組小鼠給藥后第14天臟器指數(shù)比較()

      腎10.21±1.49 13.90±1.00 9.59±0.83 9.66±0.65心4.08±0.27 4.11±0.46 3.85±0.59 4.01±0.65肝40.33±5.19 41.10±2.12 38.76±3.31 41.32±2.16脾1.98±0.14 2.51±0.41 2.04±0.23 2.45±0.65肺5.77±1.05 6.08±0.80 5.93±0.66 5.91±1.48組別空白組給藥組性別雌性雄性雌性雄性胸腺2.61±0.09 2.30±0.44 2.69±0.52 2.40±0.23

      3.5 2組小鼠給藥前后體質(zhì)量變化比較 稱量給藥前和給藥后第 1、2、3、4、5、7、9、11、14 天體質(zhì)量,記錄體質(zhì)量變化。經(jīng)統(tǒng)計分析,2組雌、雄小鼠各時間組間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表3。

      表3 2組小鼠給藥前后體質(zhì)量變化比較()g

      表3 2組小鼠給藥前后體質(zhì)量變化比較()g

      第4天27.30±1.67 27.20±1.26 27.60±1.22 27.60±1.41給藥前22.67±0.94 22.70±0.07 22.00±0.94 22.40±1.16第1天24.30±1.06 24.50±1.72 24.00±0.79 24.50±1.33第2天25.40±0.24 25.90±1.88 25.80±1.39 25.50±1.50第3天26.90±1.88 26.30±1.75 26.90±1.33 26.80±1.10組別空白組給藥組性別雌性雄性雌性雄性第5天28.10±1.64 28.60±0.59 28.70±1.41 28.50±0.89第11天31.90±1.56 34.20±0.81 31.50±1.32 34.60±1.76第7天29.00±0.13 31.60±0.50 29.20±0.81 32.90±1.00第9天30.70±1.63 33.00±1.40 30.60±0.78 33.60±1.37第14天32.70±1.54 35.00±1.26 32.80±1.15 35.60±0.78組別空白組給藥組性別雌性雄性雌性雄性給藥后給藥后

      4 討 論

      實驗研究證明,三葉青藤葉配方顆粒具有良好的抗炎作用[10]。經(jīng)初步安全性預(yù)實驗,以最大給藥濃度、最大給藥體積小鼠1次口服灌胃,無Dm值(100%死亡率),故選擇MTD試驗法進行三葉青藤葉配方顆粒急性毒性試驗。根據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》,計算小鼠最大耐受藥量倍數(shù),以耐受人臨床用量的100倍以上為安全,根據(jù)三葉青成人民間服用量15 g/d計算,小鼠最大耐受藥量是臨床用量的121.6倍以上,提示三葉青藤葉配方顆粒毒性低,口服用藥安全。

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