山奈酚抑制人膽囊癌細(xì)胞增殖及其對(duì)mTORC1通路的影響

侯敬申，梁穎濤，王偉雄，趙莉

(1.廣州醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 急診外科，廣東 廣州 51026；2.廣州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 511436)

起源于膽囊上皮的膽囊癌(gallbladder cancer, GBC)是膽道系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，早期缺乏典型癥狀而不易診斷，同時(shí)因膽囊特殊的解剖結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的毗鄰關(guān)系，其根治性切除率低，預(yù)后極差[1].目前最主要的治療手段是手術(shù)治療，結(jié)合輔助化療，但其化療敏感性較差且耐藥譜較廣[2].目前膽囊癌的整體治療效果并不理想，5年生存率為5%～10%[3].臨床需要一種更安全有效的治療方式來改善膽囊癌患者術(shù)后的生活質(zhì)量.

本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度山奈酚對(duì)人膽囊癌細(xì)胞株SGC-996細(xì)胞增殖、凋亡以及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1, mTORC1)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，來探討山奈酚對(duì)人膽囊癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

人膽囊癌細(xì)胞株SGC-996細(xì)胞購于中科院上海細(xì)胞庫；山奈酚(kaempferol)(純度>97%)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、β-巰基乙醇及十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)均購于美國Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購于美國Invitrogen公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司、細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)購于日本Dojindo株式會(huì)社；細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、離心管均購于美國Corning公司；胰蛋白酶、新生牛血清(newborn calf serum, NCS)均購于澳大利亞Serana公司；兔多克隆抗體p-AKT(Ser473)購于美國Cell Signaling Technology公司；小鼠單克隆抗體β-actin，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗均購于美國Santa Cruz公司；蛋白marker、BCA法蛋白定量試劑盒均購于美國Thermo Fisher Scientific公司；硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane, NC膜)購于美國BioRad公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于中國南京建成生物工程研究所；分析純丙三醇(甘油)購于中國廣州化學(xué)試劑廠.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑配制

25 mg山奈酚粉末溶于873 μL DMSO，充分溶解配成濃度為100 mmol/L的儲(chǔ)液，分裝并于-20 ℃避光保存.取濃度為1 mol/L的Tris-HCl (pH 6.8)體積0.625 mL，SDS質(zhì)量0.2 g，甘油體積1 mL，β-巰基乙醇體積0.5 mL，加雙蒸水補(bǔ)至體積5 mL，配制成2× Laemmli Sample Buffer.

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SGC-996細(xì)胞使用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% NCS的低糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng).

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞體外增殖能力

將對(duì)數(shù)生長期的SGC-996細(xì)胞以1×105/孔接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，12 h后進(jìn)行無血清同步化，12 h后分別加入濃度為0、25、50、75、100、125、150、175 μmol/L的山奈酚，每組設(shè)6個(gè)平行孔.藥物干預(yù)47 h時(shí)，每孔加入體積為10 μL的CCK-8試劑，繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h.將96孔板置于酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測各孔光密度D(450 nm).以各組光密度值做細(xì)胞生長曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

生長狀態(tài)良好的SGC-996細(xì)胞以2×106/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板.12 h后，根據(jù)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及凋亡預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，棄去原來培養(yǎng)基，分別加入濃度為0、50及100 μmol/L的山奈酚繼續(xù)干預(yù)細(xì)胞48 h，棄去原有培養(yǎng)基，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后，棄上清，加入預(yù)冷PBS重懸吹散細(xì)胞，再次離心后，以新鮮PBS重懸細(xì)胞，按照南京建成Annexin Ⅴ凋亡檢測試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀檢測凋亡和死亡細(xì)胞比例.

1.2.5 Western blot法檢測蛋白表達(dá)

生長狀態(tài)良好的SGC-996細(xì)胞以2×106/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，12 h后，根據(jù)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇加入濃度為0、25、50、100及150 μmol/L的山奈酚進(jìn)行干預(yù)，培養(yǎng)48 h，棄掉培養(yǎng)基，加入2× LaemmLi Buffer，刮取并收集細(xì)胞裂解液，BCA法進(jìn)行蛋白定量分析，100 ℃煮沸5 min，低溫高速離心3 min，立刻進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳.電泳結(jié)束后，1×TBST洗膜3次，每次7 min，加入脫脂牛奶室溫封閉1 h，1×TBST洗膜3次，加入稀釋后的一抗(V一抗∶V抗體稀釋液=1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；1×TBST洗膜3次后，加入稀釋后HRP標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔或者兔抗羊二抗(V二抗∶V抗體稀釋液=1∶1 500)，室溫孵育50 min，1×TBST洗膜3次后，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯色1 min左右，壓片檢測mTORC1信號(hào)通路中目的蛋白的變化.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 山奈酚對(duì)SGC-996細(xì)胞體外增殖能力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與0 μmol/L組比較，75 μmol/L及以上濃度組的SGC-996細(xì)胞體外增殖能力下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；隨作用時(shí)間繼續(xù)延長至72 h，濃度為50 μmol/L的山奈酚對(duì)SGC-996細(xì)胞體外增殖能力也表現(xiàn)出抑制作用，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖1).

1)與0 μmol/L組比較，P<0.05.

2.2 山奈酚對(duì)SGC-996細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，干預(yù)48 h后，與0 μmol/L組相比，100 μmol/L組的山奈酚能明顯誘導(dǎo)SGC-996細(xì)胞發(fā)生凋亡(20.29±1.62vs12.42±2.37，P<0.05).圖2為其中一次流式檢測的結(jié)果.

1)與0 μmol/L組比較，P<0.05.

2.3 山奈酚對(duì)SGC-996細(xì)胞mTORC1通路蛋白表達(dá)的影響

為了明確mTORC1通路在山奈酚抑制SGC-996細(xì)胞增殖中的作用，本研究檢測了該通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與0 μmol/L組相比，濃度為100及150 μmol/L的山奈酚干預(yù)48 h后，P-S6K1及P-S6蛋白表達(dá)水平較明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖3).

1)與0 μmol/L組比較，P<0.05.

3 討論

山奈酚為黃色針晶，微溶于水，溶于熱乙醇、乙醚和堿.主要來源于姜科植物山奈和小檗科植物窩兒七的根莖，屬于黃酮醇類，存在于多種植物中的多酚化合物，具有抗腫瘤等多種藥用價(jià)值.現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，山奈酚抗腫瘤作用主要表現(xiàn)在抗細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、干預(yù)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和增強(qiáng)抑癌基因活性及抑制癌基因表達(dá)等方面.有研究報(bào)道山奈酚可通過不同作用機(jī)制抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞、大鼠前列腺癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞、成髓細(xì)胞瘤細(xì)胞、大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞和人宮頸癌 HeLa細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞的生長或誘導(dǎo)其凋亡[4-8].近年來國內(nèi)外大量研究表明山奈酚在體外能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，且可通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，而具體的凋亡機(jī)制可能與細(xì)胞的類型、狀態(tài)、信號(hào)途徑中的各個(gè)效應(yīng)器的活性和功能相關(guān)[9-16].

膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國逐年增高.由于無特異性的臨床表現(xiàn)，膽囊癌臨床發(fā)現(xiàn)時(shí)多屬中晚期，根治性切除率低，預(yù)后差，嚴(yán)重危害人類健康.近年研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚具有抗菌、抗炎、抗腫瘤作用，具有誘變劑活性，濃度為100 μmol/L時(shí)可抑制淋巴細(xì)胞增殖[4, 17].本研究結(jié)果顯示在0～175 μmol/L 濃度范圍內(nèi)的山奈酚干預(yù)48 h后，與0 μmol/L組相比，濃度為75 μmol/L及以上的山奈酚對(duì)人膽囊癌細(xì)胞株SGC-996細(xì)胞開始發(fā)揮抑制增殖的作用，隨著作用時(shí)間延長到72 h時(shí)，濃度為50 μmol/L的山奈酚也明顯抑制SGC-996細(xì)胞的增殖，這種抑制作用隨著山奈酚干預(yù)濃度的增加而增強(qiáng).

細(xì)胞增殖主要受細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡兩個(gè)因素影響.本研究利用流式細(xì)胞儀檢測SGC-996細(xì)胞的凋亡情況,結(jié)果顯示:與0 μmol/L組比較，濃度為50 μmol/L的山奈酚干預(yù)48 h對(duì)SGC-996細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用不明顯，而濃度為100 μmol/L的山奈酚干預(yù)下的SGC-996細(xì)胞則已發(fā)生明顯的凋亡.

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種進(jìn)化上保守的、相對(duì)分子量為289的絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3-K)相關(guān)激酶(PI3-K-related kinase,PIKK)家族.mTOR信號(hào)通路整合來自細(xì)胞內(nèi)外的各種信號(hào)，對(duì)細(xì)胞的代謝、生長增殖及存活等生理過程發(fā)揮著中心調(diào)節(jié)作用.營養(yǎng)(氨基酸、生長因子)、能量、氧氣及應(yīng)激等細(xì)胞內(nèi)外的各種刺激可通過mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯、脂類合成、線粒體能量代謝、細(xì)胞生長增殖、衰老等重要生理過程[18-23].mTOR通路在多種細(xì)胞生理或病理進(jìn)程中都呈現(xiàn)過度活化狀態(tài)(例如腫瘤形成和血管生成、胰島素抵抗、脂肪合成以及T淋巴細(xì)胞活化等)，而在許多人類疾病，如癌癥和2型糖尿病中，mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)均發(fā)生異常.這些研究結(jié)果使mTOR信號(hào)通路成為基礎(chǔ)研究和臨床研究的熱點(diǎn)，隨著mTOR抑制劑(雷帕霉素及其類似物)廣泛應(yīng)用于臨床治療，例如對(duì)于實(shí)體瘤、器官移植、冠狀動(dòng)脈再狹窄以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療，mTOR信號(hào)通路的重要性越發(fā)突顯[24].

細(xì)胞內(nèi)mTOR信號(hào)通路主要有兩種活性形式mTORC1(mTOR complex 1)和mTORC2(mTOR complex 2).mTORC1信號(hào)通路由mTOR、mTOR調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白(regulatory associated protein of mTOR, Raptor)、mLST8(mammalian lethal with SEC13 protein 8)和相對(duì)分子量為40的富含脯氨酸蛋白激酶B底物(protein-rich Akt substrate of 40, PRAS40)組成，接受激素、生長因子、氨基酸及能量、應(yīng)激等刺激.其直接底物為40S核糖體蛋白S6激酶(40S ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1)和真核細(xì)胞翻譯起始因子4E-結(jié)合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1, 4E-BP1).S6K1的389位蘇氨酸被磷酸化后，使S6K1激活后，通過磷酸化其底物核糖體蛋白S6的235/236位絲氨酸，進(jìn)而促進(jìn)核糖體的發(fā)生；而4E-BP1磷酸化后其活性則被抑制，不能再結(jié)合并抑制真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)，eIF4E是一種帽結(jié)合蛋白，可以特異性地識(shí)別mRNA的5′端的帽子(cap)結(jié)構(gòu)，從而啟動(dòng)cap依賴的蛋白翻譯過程.二者磷酸化后能共同促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成及細(xì)胞生長與增殖[22,24].S6K1是mTORC1信號(hào)通路最具特征的效應(yīng)分子，其調(diào)節(jié)方式常被作為研究mTORC1信號(hào)通路的模型.本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在濃度為0～150 μmol/L 的山奈酚干預(yù)48 h后，濃度為100及150 μmol/L的山奈酚干預(yù)的SGC-996細(xì)胞中P-S6K1及P-S6蛋白表達(dá)水平較0 μmol/L組顯著下降，這間接提示山奈酚可以抑制mTORC1信號(hào)通路的活性.

本研究表明山奈酚在一定濃度范圍內(nèi)可劑量和時(shí)間依賴性地抑制膽囊癌細(xì)胞株SGC-996的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，而對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過影響mTORC1信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的，但是具體通過何種機(jī)制影響mTORC1信號(hào)通路尚有待進(jìn)一步深入探討.