高膽紅素血癥新生兒血紅蛋白A、F與G-6-PD表達的相關性

賴苑雙，黎維丹，胡向國，查顯豐

(暨南大學 附屬第一醫(yī)院 臨床檢驗中心，廣東 廣州 510630)

新生兒高膽紅素血癥(neonatal hyperbilirubinemia，NHB)是兒科的常見疾病，發(fā)生率為健康足月兒的66.7%，約占住院新生兒疾病總發(fā)生率的40%[1-2].NHB由多種病理因素引起, 嚴重者可引起不同程度的腦損傷,導致核黃疸, 若未及時治療，可引發(fā)膽紅素腦病甚至危及生命[3-5].

臨床上新生兒由于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PD)缺乏引起的溶血性黃疸的發(fā)病率特別高，廣東地區(qū)是G-6-PD缺乏癥的高發(fā)區(qū)[6].新生兒高膽紅素血癥的病因主要是紅細胞破壞過多，導致紅細胞數(shù)下降以及血中膽紅素濃度的升高.新生兒機體通過造血代償，可能會導致血紅蛋白A(HbA)增高和胎兒血紅蛋白F(HbF)減少.HbF是胎兒期的主要血紅蛋白，出生后由HbA所替代，已有文獻報道胎兒出生后HbF水平及消失方式[7].但目前國內有關新生兒高膽紅素血癥與新生兒G-6-PD及HbF表達的相關性鮮有研究.探明新生兒高膽紅素血癥與新生兒G-6-PD及HbF表達的相關性，可為高膽紅素血癥患兒提供有意義的臨床資料，對高膽紅血癥的診斷有一定的臨床指導意義.

本研究通過對2014年1月至2018年10月暨南大學附屬第一醫(yī)院住院的新生兒高膽紅素血癥病例進行初步回顧性研究與描述性分析，以期探討新生兒高膽紅素血癥與Hb、HbF及G-6-PD濃度的相關性及其臨床意義.

1 對象與方法

1.1 研究對象

全部資料來自2014年1月至2018年10月在暨南大學附屬第一醫(yī)院進行了血紅蛋白電泳及G-6-PD篩查的新生兒2 932例，其中男1 614例、女1 318例，日齡<28 d，中位日齡為4 d.總膽紅素濃度、血紅蛋白電泳、血紅蛋白質量濃度(Hb)、G-6-PD活性檢測結果由暨南大學附屬第一醫(yī)院檢驗科提供.

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑與儀器

膽紅素及G-6-PD的檢測，采用日本產日立7600型全自動生化分析儀.膽紅素測定試劑為日本和光純藥工業(yè)株式會社生產的釩酸氧化法膽紅素測定試劑盒，G-6-PD定量測定試劑盒購自廣州科方生物技術有限公司.血紅蛋白電泳采用法國SEBIA公司生產的SEBIA-MINICAP毛細管電泳儀，試劑盒購自SEBIA公司.

1.2.2 高膽紅素血癥診斷標準

參照《實用新生兒學》和新生兒黃疸干預推薦方案的新生兒高膽紅素血癥的診斷標準，總膽紅素濃度>153 μmol/L，72 h后總膽紅素濃度>205 μmol/L，早產兒總膽紅素濃度>255 μmol/L，均以間接膽紅素升高為主，符合以上標準者診斷為高膽紅素血癥[8-10].

1.3 測定方法及原理

1.3.1 膽紅素濃度的測定

利用釩酸氧化法測定總膽紅素(total bilirubin,TBIL)濃度.在表面活性劑和化學氧化劑的存在下，pH值3.0附近, 表面活性劑和釩酸將血清中的TBIL在一定時間內氧化成膽綠素，此時膽紅素所呈的黃色減少.反應前后的光密度差與TBIL濃度成正比.在450 nm波長下測定氧化劑加入前后的光密度之差，定量求得血清中TBIL的濃度.

1.3.2 G-6-PD的檢測

操作按照試劑盒說明書進行，分別測定紅細胞中G-6-PD與6-磷酸葡糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase, 6-PGD)的活性，A液用于測定G-6-PD活性，B液用于測定6-PGD活性，兩者分別在不同的通道內測定.反應原理均為催化其相應的底物反應，同時將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADP)還原為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide Phosphate,NADPH)，通過監(jiān)測340nm處光密度上升的速率即可計算兩者的活性，再計算兩者的比值，G-6-PD/6-PGD<1.0即確診為G-6-PD 缺乏癥.G-6-PD/6-PGD≤0.6為重度缺乏，G-6-PD/6-PGD<1.0 為中度缺乏，G-6-PD/6-PGD>1.1為正常.

1.3.3 血紅蛋白HbA和HbF質量濃度的檢測

采用血紅蛋白毛細管電泳法，由于血紅蛋白中的各組分其分子表面所帶電荷性質與數(shù)量不同而等電點各異.在不同pH的電場中，因其所帶電荷差異而泳動速度不同.由此可將血紅蛋白的各組分HbA和HbF分開.根據(jù)電泳圖譜的峰面積計算出HbA和HbF的百分比，然后乘以血紅蛋白的質量濃度(Hb)，從而得到HbA和HbF的質量濃度.

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 住院新生兒高膽紅素血癥及G-6-PD缺乏的發(fā)病率

本研究統(tǒng)計了2 932例住院新生兒，高膽紅素血癥的發(fā)病率為72.7%，其中男性新生兒的發(fā)病率為72.4%，女性新生兒為73.1%，提示高膽紅素血癥是住院新生兒的主要疾病.

2 932例新生兒中共有292例患兒G-6-PD缺乏，患病率為10.0%，其中重度缺乏占7.4%，中度缺乏占2.6%；男性新生兒G-6-PD缺乏為197人，占6.7%，其中重度缺乏190例，占6.5%，中度缺乏7例，占0.2%；女性新生兒為95人，占3.2%，其中重度缺乏27列，占0.9%，中度缺乏68例，占2.3%；男性新生兒G-6-PD缺乏患病率是女性新生兒的2倍.

2.2 新生兒高膽紅素血癥發(fā)病與G-6-PD缺乏之間的相關性

G-6-PD缺乏是導致新生兒高膽紅素血癥的原因之一，一旦發(fā)病，病程一般進展較快[11]，為此本實驗根據(jù)G-6-PD酶活性對其缺乏程度進行分組，將住院新生兒分為G-6-PD重度缺乏組、G-6-PD中度缺乏組和正常新生兒組3組，觀察不同G-6-PD缺乏其血清TBIL濃度，結果顯示G-6-PD重度缺乏新生兒血清TBIL濃度(245.0±126.9)μmol/L明顯高于正常新生兒血清TBIL濃度(224.1±114.0)μmol/L(P=0.016 2)，而G-6-PD中度缺乏新生兒血清TBIL濃度(217.5±126.7)μmol/L與G-6-PD重度缺乏新生兒和正常新生兒之間血清TBIL濃度無統(tǒng)計學差異(P=0.098 9，P=0.657 0，圖1).

圖1 G-6-PD缺乏患兒與正常新生兒血清膽紅素的濃度

G-6-PD缺乏是不是一定能夠導致高膽紅素血癥呢？進一步觀察G-6-PD缺乏患兒高膽紅素血癥的發(fā)病情況，結果顯示G-6-PD缺乏的292例新生兒中高膽紅素血癥為223例(占76.4%),其中G-6-PD重度缺乏合并高膽紅素血癥有172例(占5.8%)，G-6-PD中度缺乏合并高膽紅素血癥有51例(占1.7%)，2 640例G-6-PD正常對照組中高膽紅素血癥有1 908例(占72.3%)，3組之間無明顯統(tǒng)計學差異(2=5.782，P=0.055)，因此還不能說明G-6-PD缺乏是引起新生兒高膽紅素血癥的一個主要原因.同時，本實驗對性別不同新生兒的G-6-PD缺乏者的高膽紅素血癥患病情況進行分析，發(fā)現(xiàn)新生兒G-6-PD缺乏者合并高膽紅素血癥男性(155例，占5.3%)發(fā)病率明顯高于女性(68例，占2.3%).

2.3 高膽紅素血癥患兒與正常新生兒Hb和HbF質量濃度的比較

新生兒膽紅素增高主要是由紅細胞破壞增多引起的，因此觀察高膽紅素血癥患兒的Hb質量濃度及其組分HbF和HbA是否發(fā)生變化.研究發(fā)現(xiàn)高膽紅素血癥組Hb質量濃度(162.9±22.2)g/L明顯低于正常新生兒組Hb質量濃度(165.1±22.5)g/L(P<0.000 1)，高膽紅素血癥患兒其組分HbF質量濃度(132.2±22.8)g/L明顯低于膽紅素正常組其組分HbF質量濃度(137.0±26.1)g/L(P<0.000 1)，而HbA質量濃度(30.4±10.2)g/L則明顯高于膽紅素正常組的HbA質量濃度(27.5±12.6)g/L(P<0.000 1,圖2).

進一步將高膽紅素血癥組和正常組根據(jù)G-6-PD缺乏程度分成總膽紅素正常且G-6-PD正常組(TBIL-G6PD-)、總膽紅素正常而G-6-PD缺乏組(TBIL-G6PD+)、高膽紅素血癥而G-6-PD正常組(TBIL+G6PD-)和高膽紅素血癥合并G-6-PD缺乏組(TBIL+G6PD+)，分析G-6-PD缺乏對Hb及其組分影響.結果發(fā)現(xiàn)無論在高膽紅素血癥還是TBIL正常組中G-6-PD正常新生兒的Hb質量濃度(164.1±21.8)、(166.0±22.6)g/L和HbF質量濃度(134.1±22.6)、(138.0±26.3)g/L都明顯高于G-6-PD缺乏癥新生兒的Hb質量濃度(152.9±22.7)、(155.7±19.4)g/L和HbF質量濃度(121.6±22.1)、(126.9±22.9)g/L(P<0.000 1，P<0.000 1；P=0.000 3，P=0.000 7)，而HbA質量濃度在G-6-PD正常組與G-6-PD缺乏組之間都無統(tǒng)計學差異(P=0.409 7，P=0.710 4，圖3).

圖2 高膽紅素血癥患兒Hb、HbF和HbA的質量濃度比較

圖3 G-6-PD缺乏和正常的高膽紅素血癥新生兒的Hb、HbA和HbF的質量濃度

3 討論

新生兒高膽紅素血癥是指由于疾病或某些致病因素所引起血清膽紅素超過生理性黃疸的診斷標準, 亦稱為病理性黃疸, 是新生兒時期的常見病[12].本研究中新生兒高膽紅素血癥的發(fā)病率為72.7%.引起新生兒高膽紅素血癥的機制主要包括膽紅素產生增加(如ABO血型不符、G-6-PD 缺乏癥和血腫等)導致紅細胞破壞增多和膽紅素排泄減少(如早產兒葡萄糖醛酸轉移酶活性低，肝炎，膽道閉鎖)等所導致.

G-6-PD 缺乏癥是X 染色體連鎖不完全顯性遺傳的一種紅細胞酶缺陷病，是引起血清膽紅素增高的一個潛在因素.G-6-PD 缺乏時, 由于紅細胞內磷酸戊糖代謝受阻，NADPH 及谷胱甘肽(glutathione, GSH)生成不足，細胞代謝過程中生成的過氧化氫毒性未能及時清除而受影響, 在臨床上主要表現(xiàn)為先天性非球形紅細胞性溶血,即在無誘因的情況下出現(xiàn)慢性溶血[13].本研究發(fā)現(xiàn)在我院住院新生兒G-6-PD 缺乏具有很高的發(fā)病率，約10.0%，與文獻報道的廣東地區(qū)G-6-PD缺乏發(fā)病率大體一致[14]，其中男性新生兒檢測出G-6-PD 缺乏者比率是女性新生兒的2倍左右,原因跟X 染色體連鎖不完全顯性遺傳有關.G-6-PD缺乏癥是不是引起新生兒高膽紅素血癥的主要因素呢？本實驗分析了G-6-PD 缺乏的住院新生兒高膽紅素血癥患病率，發(fā)現(xiàn)G-6-PD 缺乏的新生兒高膽紅素血癥總的患病率(76.4%)未明顯高于G-6-PD正常患兒(72.3%), 提示G-6-PD酶活性跟新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生沒有直接的相關性.這是由于G-6-PD酶缺乏癥患者只有在某些誘因如藥物、感染、食物、圍產等因素的作用下才會引起急性溶血, 紅細胞大量破壞, 膽紅素產生過量和葡萄糖醛轉移酶發(fā)育不成熟而引起肝細胞攝取膽紅血素能力不足, 形成膽紅素能力低下、排泄膽紅素功能不成熟, 致使非結合膽紅素潴留血液而發(fā)生黃疸[15].因此，G-6-PD 缺乏者并不一定就會發(fā)生新生兒高膽紅素血癥，但在誘因存在的情況下G-6-PD酶缺乏可能是引起新生兒高膽紅素血癥的一個病因，其中，由于G-6-PD 缺乏癥X 染色體連鎖不完全顯性遺傳病，男性屬于半合子，缺乏程度為重度，而女性多數(shù)為雜合子，少數(shù)為純合子，缺乏程度較輕，所以男性新生兒G-6-PD缺乏者更容易誘發(fā)新生兒黃疸，一旦發(fā)病，要對癥處理，因此對新生兒應進行常規(guī)的G-6-PD酶活性的檢查，及早采取預防措施，控制誘因，可大大減少該病的發(fā)生[16].此外，研究還發(fā)現(xiàn)在G-6-PD重度缺乏新生兒中，盡管TBIL濃度增高未達到診斷新生兒高膽紅素血癥的標準，但是血清TBIL的濃度還是明顯高于正常新生兒，提示G-6-PD重度缺乏新生兒機體內存在輕微的紅細胞被破壞.

新生兒出生血紅蛋白的主要成分是胎兒血紅蛋白HbF(α2γ2)，胎兒出生后機體在基因轉錄水平上, 胎兒γ-基因停止了轉錄, 而成人β-基因轉錄水平明顯增加, 與此相應的 HbF 轉換為成人型 HbA(α2β2)[17].高膽紅素血癥主要是由紅細胞破壞引起的，所以對高膽紅素血癥新生兒的血紅蛋白及其組分和HbF進行分析，探討高膽紅素血癥患兒的血紅蛋白及其組分HbA和HbF有沒有發(fā)生改變.實驗發(fā)現(xiàn)高膽紅素血癥組Hb和HbF質量濃度明顯低于膽紅素正常組，而HbA的質量濃度明顯高于膽紅素正常組.導致這一變化的原因可能是新生兒高膽紅素血癥體內由于紅細胞破壞過多導致紅細胞數(shù)下降，新生兒機體會通過造血代償，刺激了紅細胞加速由γ鏈的合成轉換為β鏈的合成，從而導致HbA合成增高和胎兒HbF減少.進一步分析發(fā)現(xiàn)無論在膽紅素正常新生兒還是高膽紅素血癥患兒中，G-6-PD缺乏者Hb和HbF的質量濃度都明顯低于G-6-PD正常者，而HbA質量濃度則沒有顯著差異，顯示在沒有誘因的情況下G-6-PD缺乏患兒體內紅細胞還是會發(fā)生破壞或者紅細胞破壞的速率較正常新生兒要高，而機體代償性合成HbA的質量濃度卻未明顯增加，從而導致新生兒貧血.

綜上所述，本研究通過分析了住院新生兒G-6-PD酶活性與新生兒高膽紅素血癥發(fā)病的關系，發(fā)現(xiàn)G-6-PD酶缺乏并不是引起G-6-PD酶缺乏高發(fā)區(qū)住院新生兒高膽紅素血癥發(fā)病的主要原因；同時首次觀察了高膽紅素血癥新生兒的Hb及其組分HbA和HbF的表達情況，發(fā)現(xiàn)高膽紅素血癥新生兒的Hb及其組分HbF質量濃度明顯降低，HbA質量濃度則明顯增加，這些結果為全面了解新生兒高膽紅素血癥的病理生理提供基礎數(shù)據(jù)，也提示通過血紅蛋白電泳檢測Hb及其組分HbA和HbF可能對新生兒高膽紅素血癥的診斷和治療有一定的臨床意義.