右美托咪定誘導的肌細胞鈣濃度雙相增加與能量代謝之間的相關(guān)性

許占宏,房麗華,李淑艷,董 冉

(1.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 麻醉科,黑龍江 哈爾濱150010；2.哈爾濱市兒童醫(yī)院)

右美托咪定(DEX)是目前被較廣應(yīng)用于圍手術(shù)期以及重癥監(jiān)護室的高選擇性的α2腎上腺素能受體激動藥[1]，在圍手術(shù)期及重癥監(jiān)護室患者使用時能產(chǎn)生近似自然睡眠的穩(wěn)定、鎮(zhèn)靜作用[2]，有利于維持患者血流動力學上的穩(wěn)定，具有保護患者的心、肝、腦等器官的功能特性[3,4]，同時還具有一定的利尿、抗焦慮的作用，并且其對于呼吸的抑制作用也很輕微[5-7]。鈣是人體中的主要常量元素之一， Ca2+做為第二信使會參與到細胞活動的調(diào)節(jié)中。胞內(nèi)游離的鈣離子濃度的變化，對于維持細胞質(zhì)膜以及細胞器膜兩側(cè)的跨膜Ca2+梯度差、以及實現(xiàn)信息跨膜傳導具有重要調(diào)節(jié)的作用[8-12]。目前關(guān)于右美托咪定誘導的肌細胞鈣濃度雙相增加與能量代謝之間的相關(guān)性研究較少，本實驗將通過研究探討右美托咪定的作用對肌細胞鈣濃度增加與能量代謝之間關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

實驗中選取出生5天后的雄性Wistar大鼠做為研究對象，實驗大鼠采購自華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心，動物合格證號是：SCXX (鄂)2004-2007。共分為2大組：對照組以及右美托咪定處理組(低劑量0.1 μmol/L、高劑量1 μmol/L)。

1.2 方法

1.2.1肌細胞培養(yǎng)過程 將出生5天后的雄性Wister大鼠殺掉，先采用70%濃度的酒精進行浸泡30 min消毒，無菌紙擦干，于大鼠的肩關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)處進行解剖，用磷酸鹽緩沖液沖洗數(shù)次后，剪掉大鼠的脂肪去除骨骼，剪碎成1 mm×1 mm×1 mm碎塊備用，用0.1%的胰蛋白酶將組織多次消化得到單個的細胞懸浮液，離心分離后得到沉淀，用含20%小牛血清的DMEM懸浮分散大鼠細胞，培養(yǎng)接種于25 ml容量的培養(yǎng)瓶中，放在37℃的二氧化碳的孵箱內(nèi)進行培養(yǎng)，每日更換培養(yǎng)液[13]。實驗開始前可用無血清的DMEM培養(yǎng)24 h，使得細胞周期同步。其中對照組按正常培養(yǎng)肌細胞流程進行培養(yǎng)，不做任何其他處理；而右美托咪定組添加低劑量組(0.1 μmol/L)和高劑量組(1 μmol/L)濃度的DEX處理，其余不變。

1.2.2熒光蛋白鈣指示劑測定肌細胞中鈣離子含量 采用fura-2熒光鈣離子指示劑測定肌細胞中鈣離子的含量，測定原理為當肌細胞結(jié)合鈣離子后，熒光的最大激發(fā)波長會從363 nm(末結(jié)合鈣離子)變成335 nm(鈣離子飽和)，同時發(fā)射熒光的最大波長大約在510 nm左右，未發(fā)生變化。探針會在340 nm和380 nm波長光處被激發(fā)，通過使用與兩種激發(fā)對應(yīng)的熒光強度的比率，來計算大鼠肌細胞內(nèi)的鈣離子濃度[14]。當細胞經(jīng)fura-2負載后，利用F4500熒光分光光度計進行熒光強度的測定，激發(fā)波長為340 nm，發(fā)射波長為510 nm。

1.2.3肌細胞中線粒體琥珀酸脫氫酶(MSDH)的測定 肌細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶會形成將外源性噻唑藍還原成藍紫色的結(jié)晶物的現(xiàn)象，從而產(chǎn)生沉淀，然而死細胞無法完成此還原的過程[15]。實驗中將肌細胞采用二甲亞砜溶液溶解，于570 nm處酶標儀測定其吸光度(A)值，從而反映出線粒體的功能。

1.2.4肌細胞線粒體膜電位的測定 將處理后的肌細胞去掉其上清液，加入提前配置好的緩沖液 (氯化鈉122 mmol/L，碳酸氫鈉25 mmol/L，硫酸鎂1.2 mmol/L，磷酸氫二鈉0.4 mmol/L，氯化鈉1.4 mmol/L，4-羥乙基哌嗪乙磺酸10 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L)，37℃條件下預溫孵30 min，然后換成含有20 μmol/L Rh123的緩沖液在溫孵120 min，用冰冷的緩沖液沖洗3次后，即終止孵育。1420Victor多標記免疫分析儀，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為535 nm處測熒光強度，以熒光強度來表示肌細胞中線粒體膜電位的變化[16]。

1.2.5肌細胞中ATP，ADP，AMP含量變化的測定 將培養(yǎng)處理后的肌細胞培養(yǎng)液中加入0.1 mol/L的高氯酸1 ml，于4℃，15 000 g離心10 min， 取 上清液用0．5 mol/L碳酸鈉溶液中和調(diào)整pH至6.5-7，再重復離心1次，取離心后的上清液做高效液相色譜分析[17]。

1.2.6肌細胞細胞凋亡測定 每組取6個孔板，0.125%胰酶消化并收集細胞。根據(jù)膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸酯/碘化丙啶雙標試劑盒說明，用雙蒸水1∶4比例稀釋結(jié)合緩沖液，PBS洗滌細胞后，以稀釋的結(jié)合緩沖液重懸細胞，并調(diào)整細胞的密度為2×105/mL。取細胞懸液195 μl，加入AnnexinV-FITC5 μl和PI 10 μl混合均勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，使用流式細胞儀檢測[18]。

1.2.7肌細胞Ca2+-ATPase，Na+-K+-ATPase酶活性的測定 采用孔雀綠比色法[19]測定大鼠肌細胞中Ca2+-ATPase，Na+-K+-ATPase酶的活性。

1.2.8Western Blot檢測大鼠Caspse3表達 制備不同處理組大鼠蛋白樣品，-80℃低溫處儲存，待SDS-PAGE電泳凝膠制備完成后上樣電泳分離，跑膠結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，免疫反應(yīng)后進行顯影、定影圖像分析。

1.2.9PCR技術(shù)檢測大鼠線粒體周圍能量基因的表達情況 將生產(chǎn)5天后的不同處理組的(每組15只)大鼠取血，提取其RNA做PCR檢測，取2 μg的mRNA使用superscript II和Random Primer Hexamers(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄合成并純化cDNA。在PCR Array 的96孔板中各加入20 ng的cDNA，后設(shè)置循環(huán)數(shù)進行PCR，通過計算得到每個孔板中的Ct數(shù)及每組基因的表達的差異。

1.3 統(tǒng)計學處理分析

2 結(jié)果

2.1 肌細胞中鈣離子含量變化

從表1可知，與對照組鈣濃度241.4 nmol/L相比，右美托咪定處理組促使大鼠肌細胞中鈣離子含量均增加，鈣濃度分別增加了39.0 nmol/L、61.1 nmol/L，其中右美托咪定含量越高，促使肌細胞中鈣濃度雙向增加的越多，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 不同處理條件下肌細胞鈣離子含量

注：a與對照組比較，P<0.05；b與低劑量組相比較，P<0.05。

2.2 肌細胞中線粒體琥珀酸脫氫酶(MSDH)活性比較

由表2可知，右美托咪定誘導濃度越高，線粒體中琥珀酸脫氫酶酶活性增加越多，差異具統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 不同處理條件下線粒體琥珀酸脫氫酶活性比較

注：a與對照組比較，P<0.05；b與低劑量組相比較，P<0.05。

2.3 肌細胞線粒體膜電位的變化

由表3可知，在右美托咪定的作用下，肌細胞線粒體膜電位較對照組增加，且右美托咪定誘導濃度越高，肌細胞中的線粒體膜電位增加越多，差異具統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 不同處理條件下肌細胞線粒體膜電位

注：a與對照組比較，P<0.05；b與低劑量組相比較，P<0.05。

2.4 肌細胞中ATP，ADP，AMP含量變化的測定

由表4可知，當使用右美托咪定作用于大鼠的肌細胞后，大鼠肌細胞中的ATP、ADP以及AMP均出現(xiàn)增長，且高濃度的右美托咪定使得大鼠肌細胞ATP、ADP以及AMP增加更顯著，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 不同處理條件下肌細胞中ATP、ADP、AMP含量

注：a與對照組比較，P<0.05；b與低劑量組相比較，P<0.05。

2.5 肌細胞細胞凋亡率變化

表5可知，不同處理條件下肌細胞細胞凋亡率變化情況。其中對照組細胞凋亡率正常情況下為4.58%，當使用右美托咪定作用于肌細胞后，其細胞凋亡率明顯下降，低劑量組右美托咪定肌細胞較對照組細胞凋亡率下降了1.33%，高劑量右美托咪定肌細胞較對照組細胞凋亡率下降了2.46%，呈顯著變化，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表5 不同處理條件下肌細胞細胞凋亡率

注：a與對照組比較，P<0.05；b與低劑量組相比較，P<0.05。

2.6 肌細胞中Ca2+-ATPase，Na+-K+-ATPase酶活性的測定

由表6可知，當使用右美托咪定誘導作用于肌細胞后其Ca2+-ATPase和Na+-K+-ATPase的酶活性均增加，且右美托咪定濃度越高，肌細胞的酶活性增加越高，肌細胞能量代謝相對較高，數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表6 不同處理條件下肌細胞中Ca2+-ATPase，Na+-K+-ATPase酶活性

注：a與對照組比較，P<0.05；b與低劑量組相比較，P<0.05。

2.7 Western Blot檢測大鼠Caspse3表達

從圖1可看出，各處理組Caspse3目標條帶與β-action參比條帶的灰度值，并通過軟件測定計算得到與對照組相比，右美托咪定處理組大鼠Caspse3蛋白表達基因均明顯下降。與對照組的Caspse3灰度值84.5%比，低劑量右美托咪定Caspse3灰度值為64.8%，高劑量右美托咪定Caspse3灰度值為23.4%，故右美托若定處理后細胞凋亡中Caspse3基因表達降低。

1：對照組 2：低劑量DEX組 3：高劑量DEX組

2.8 PCR技術(shù)檢測大鼠線粒體周圍能量基因的表達情況

由圖2 可知在不同右美托咪定處理后，大鼠右美托咪定組與對照組處理前后基因表達情況，Ndufa1、Ndufab1、Ndufb2、Ndufs8、Sdha基因代碼為線粒體產(chǎn)能的相關(guān)基因，可知在右美托咪定誘導處理后大鼠的Fold值均升高，且高劑量組Fold值高于低劑量組。

圖2 不同處理情況下大鼠線粒體周圍能量基因的表達

3 討論

研究表明，右美托咪定對多種器官具有保護作用[20]。人體大腦缺血會導致腦組織細胞受損，神經(jīng)元壞死凋亡，然而研究表明右美托咪定可促進抗凋亡基因的表達，抑制促凋亡基因的表達，從而減少神經(jīng)元的凋亡，同時會降低兒茶酚胺的釋放；在肺功能上，右美托咪定會產(chǎn)生抑制炎性反應(yīng)抗氧化應(yīng)激，活化AKt信號通路；對于心臟功能影響中，右美托咪定具有較好的保護作用。右美托咪定可直接作用于心肌細胞，降低心肌缺血再灌注導致去甲腎上腺素的釋放，同時減輕凋亡和炎癥反應(yīng)等等[21]。

右美托咪定對于大腦、心臟、肝臟、腎功能、腸黏膜等均具有一定的保護作用，尤其在圍手術(shù)期對心臟的保護作用上[22]。Ca2+在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的過程需要Ca2+-Mg2+-ATP酶的磷酸化和ATP水解供能，同時將連接的2個Ca2+釋放到胞漿，引起肌細胞代謝變化。已有研究表明[12]，右美托咪定可抑制鈣離子通道的開放，同時會激活外向型的鉀離子通道的開放，降低細胞內(nèi)鈣離子濃度，并會改變?nèi)梭w內(nèi)神經(jīng)元線粒體膜電位的變化，然而目前關(guān)于右美托咪定對于肌細胞鈣濃度增加與能量代謝之間關(guān)系的研究較少。右美托若定對膿毒癥患者外周線粒體能量代謝的研究中發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者會由于炎癥反應(yīng)使得人體線粒體功能受損，線粒體產(chǎn)能基因受阻導致能量代謝減少，而當在早期使用右美托咪定時，線粒體產(chǎn)能基因表達增強，從而使機體的代謝水平較未使用患者增加[23,24]。在本文的研究中發(fā)現(xiàn)右美托咪定促使肌細胞鈣濃度雙相增加，且右美托咪定誘導劑量越高，肌細胞中測定的鈣離子含量越高，而鈣離子參與到細胞活動的調(diào)節(jié)中，且在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的過程需要Ca2+-Mg2+-ATP酶的磷酸化和ATP水解供能，同時將連接的2個Ca2+釋放到胞漿，引起肌細胞代謝變化。本研究顯示，右美托咪定處理組促使大鼠肌細胞中鈣離子含量均增加，鈣濃度分別增加了39.0 nmol/L、61.1 nmol/L；線粒體中琥珀酸脫氫酶明顯增加，在低劑量組達到(1.36±0.12)、高劑量組達到(1.68±0.17)；線粒體膜電位變化顯著增加，線粒體周圍能量基因的表達也升高，ATP、ADP、AMP以及Ca2+-ATPase，Na+-K+-ATPase酶的活性也均有所增加，使得肌細胞中能量代謝增加，細胞凋亡率下降，細胞凋亡中Caspse3基因表達也降低。

綜上所述，右美托咪定誘導使肌細胞鈣濃度雙相增加，促使線粒體中琥珀酸脫氫酶，線粒體膜電位變化以及ATP、ADP、AMP以及Ca2+-ATPase，Na+-K+-ATPase酶的活性增加，細胞凋亡率下降等變化，共同促使肌細胞三羧酸循環(huán)加快，細胞產(chǎn)能增加，能量代謝增強，機體代謝水平增強。