主動脈瓣反流合并左心室增大患者外周血差異表達(dá)環(huán)狀RNAs的篩選

文智，譚程，吳建強(qiáng)，洪瀾，薛楊，孫小康

(德陽市人民醫(yī)院，四川德陽618000)

主動脈瓣關(guān)閉不全時，左心室容量負(fù)荷加重、室壁張力增加。如心瓣膜關(guān)閉不全未能及時糾正，左心室繼續(xù)肥厚和擴(kuò)大，心肌細(xì)胞纖維化，心室壁順應(yīng)性下降，導(dǎo)致左心室功能不可逆性損害［1]。心臟超聲測量中國40～59歲漢族男性左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)正常值為 38.4 ～ 54.5 mm［2]。左心室內(nèi)徑增大是心臟瓣膜手術(shù)的獨(dú)立危險因素，也是生存率的獨(dú)立預(yù)測因子。阻止和逆轉(zhuǎn)主動脈瓣關(guān)閉不全患者的左心室重構(gòu)是目前的研究熱點(diǎn)，除從外科手術(shù)方面解決原發(fā)病因著手外，基因調(diào)控心肌細(xì)胞的重構(gòu)層面也是一個研究突破口。文獻(xiàn)［3，4]報道，miRNA－233是一種可以誘導(dǎo)心肌肥大的內(nèi)源性調(diào)節(jié)子，與心肌重構(gòu)有關(guān)。近年來，隨RNA測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用和基因芯片技術(shù)的快速發(fā)展，研究［5]發(fā)現(xiàn)許多前體mRNA可被非線性地反向剪接或通過基因重排而形成反向首尾連接的環(huán)狀RNA(circRNA)，circRNA在所有剪接轉(zhuǎn)錄本中占有較大比例。circRNA可充當(dāng)miRNA海綿，競爭性抑制miRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，有效影響miR靶基因活性，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用［6]。研究［7]表明，circNRA 不編碼蛋白，卻在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等中扮演了重要角色，能在基因組水平及染色體水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控;有著結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、豐度高、序列保守性高、組織特異性高等特點(diǎn)［8]。Memczak 等［9]通過對外周全血、組織樣本進(jìn)行 circRNAs檢測后，發(fā)現(xiàn)血液樣本中的circRNAs是穩(wěn)定且易于檢測，全血可作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來研究circRNA與特定疾病的關(guān)系。

我們采用circRNA微陣列芯片技術(shù)分析主動脈瓣反流合并左心室增大患者與主動脈瓣反流患者左心室正?；颊咄庵苎猚ircRNA表達(dá)譜，初步篩選外周血差異表達(dá)circRNAs，并尋找預(yù)測靶向吸附miRNA223的差異表達(dá)的circRNAs，從而篩選出可能參與調(diào)控主動脈瓣反流所致左心室增大的circRNAs，為進(jìn)一步進(jìn)行阻止和逆轉(zhuǎn)主動脈瓣關(guān)閉不全患者左心室重構(gòu)的研究提供初步依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年8月～2018年9月德陽市人民醫(yī)院心胸外科確診為主動脈瓣反流合并左心室增大的4例患者(觀察組)，均為男性，年齡(51.25 ±6.40)歲，漢族，左心室 LVEDD ＞60 mm;對照組選取同研究期主動脈瓣反流的4例患者，均為男性，年齡(49.5 ±5.26)歲，漢族，左心室 LVEDD 38～55 mm。納入標(biāo)準(zhǔn)：①心臟彩超提示主動脈瓣關(guān)閉不全;②超聲測量左心室LVEDD均符合左心室增大的判定標(biāo)準(zhǔn)，其余房室腔測值具有可比性;③符合手術(shù)指征且在德陽市人民醫(yī)院行單純主動脈瓣置換術(shù)：④無高血壓、糖尿病、慢性肝腎病、惡性腫瘤、結(jié)締組織病、類風(fēng)濕疾病;⑤不包括需要手術(shù)治療的其他瓣膜器質(zhì)性病變、先天性心臟病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、擴(kuò)張性心肌病。本研究經(jīng)德陽市人民醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會審核通過，標(biāo)本的采集均經(jīng)過家屬授權(quán)并簽署知情同意書。

1.2 外周血circRNAs檢測

1.2.1 標(biāo)本采集 兩組均于術(shù)前1日用 PAX-gene?全血RNA管采集外周血5 mL，液氮保存送上海康成生物公司進(jìn)行芯片檢測。

1.2.2 受檢標(biāo)本總RNA的提取與純化 按照 TRIzol試劑盒(Invitrogen公司，美國)說明，分別提取兩組外周血總RNA，利用Buffer RPE反應(yīng)體系對總RNA進(jìn)行提純，使用NanoDropDN－1000分光光度計測定濃度及230、260和280 nm處的光密度OD值，測算 OD260/OD280、OD260/OD230評估純度，采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳方法檢測RNA完整性。兩組提取總RNA的OD260/OD280均在2.00左右(1.80～2.10)，OD260/OD230均 ＞2.00，說明總 RNA 純度較高，電泳后均得到28S、18S、5S三條界限分明、位置一致的條帶，說明總RNA完整性較好。兩組抽提總RNA符合下一步RNAs基因芯片檢測的實(shí)驗(yàn)要求。

1.2.3 circRNAs檢測 ①cDNA 合成、標(biāo)記與純化采用RNA核糖核酸酶去除總RNA中的線性RNA，然后采用環(huán)狀RNA labeling(Arraystar公司，美國)轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增circRNAs成帶有熒光標(biāo)記的cRNA，并使用RNeasy小型試劑盒(Qiagen公司，德國)純化標(biāo)記的 cRNA，NanoDropDN－1000測定被標(biāo)記cRNA濃度和活性。②芯片雜交將標(biāo)記后的樣品與Human circRNA Array(6×7K)芯片(Arraystar公司，美國)進(jìn)行排列雜交，然后用Gene Expression Wash Buffer(Agilent公司，美國)進(jìn)行清洗。③芯片掃描機(jī)掃描數(shù)據(jù) 雜交芯片由Axon GenePix 4000 B(Axon公司，美國)微陣列掃描儀掃描獲得芯片圖，然后將掃描圖像導(dǎo)入GenePixPro6.0軟件(Axon)得到circRNAs原始數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用R軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分位數(shù)歸一化，兩組芯片數(shù)據(jù)經(jīng)歸一化處理后，cir-cRNA表達(dá)分布情況在8組標(biāo)本中幾乎相同，說明可進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)分析處理。通過P－value和FDR篩選兩組外周血具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異表達(dá)的circRNAs。兩個樣品間差異表達(dá) circRNAs通過熒光信號強(qiáng)度差異倍數(shù)Fold Change(FC)及 P值篩選，差異表達(dá)的circRNAs的判定標(biāo)準(zhǔn)為在4例樣本中至少有3例出現(xiàn)，以配對t檢驗(yàn)P＜0.05，F(xiàn)C值＞2(代表circRNA表達(dá)上調(diào)或下調(diào))。對芯片篩選出的差異表達(dá)circRNA作層次聚類分析，兩組外周血circRNAs的表達(dá)水平組內(nèi)一致性高，數(shù)據(jù)可用。利用 TargetScan［10]和 miRanda［11]兩個軟件預(yù)測差異表達(dá)circRNA最可能結(jié)合的miRNA，取匹配值較高的5個miRNA，并對這5個miRNA的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測和注釋，分析與心肌重構(gòu)相關(guān)miRNA－233有關(guān)聯(lián)的circRNAs。

2 結(jié)果

觀察組158個circRNA的熒光信號強(qiáng)度FC值均＞2，且與對照組比較，P均＜0.05;其中105個表達(dá)下調(diào)、53個表達(dá)上調(diào)，21個circRNAs的FC值＞5。見表1。

表1 觀察組中FC＞5的差異表達(dá)circRNAs

158個差異表達(dá) circRNAs中，hsa_circRNA_102898(下調(diào)，miR－223－3p/miR－612/miR－127－5p/miR－338－5p/miR－624－5p)、hsa_circRNA_101661(上調(diào)，miR－223－3p/miR－875－3p/miR－148b－5p/miR－92a－2－5p/miR －689)、hsa_circRNA_103740(上調(diào)，miR－362－5p/miR－223－3p/miR－362－3p/miR－622/miR－212－3p)與miRNA－233存在結(jié)合位點(diǎn)。

3 討論

circRNAs廣泛存在于全血、血清、血漿、腦脊液、尿液、精液等體液內(nèi)［12]。Memczak 等［9]對人類全血中的RNA進(jìn)行測序，結(jié)果顯示百余種circRNAs的表達(dá)量明顯高于對應(yīng)組織的 miRNA。外周血的circRNAs主要存在外泌體中，并以此作為載體在體內(nèi)運(yùn)輸，外泌體內(nèi)的脂質(zhì)分子可以對circRNAs起保護(hù)作用，是其結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定［13]，而且外泌體可以穿過血腦屏障，所以神經(jīng)系統(tǒng)病變所釋放的circRNAs也可以在血液中檢測到［14]。Zhao等［15]通過基因芯片分析冠心病患者和健康對照患者血清中的環(huán)狀RNA發(fā)現(xiàn)前者血清環(huán)狀RNA相較于后者有12種上調(diào)、10種下調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者血清中明顯上調(diào)的hsa_circ_0124644具有最高的靈敏度和特異度，且對冠心病具有更高的診斷價值。Wu等［16]通過芯片分析，發(fā)現(xiàn)高血壓患者血漿中的circRNAs相對于對照組表達(dá)下調(diào)的有13種，表達(dá)上調(diào)的有46種，has_circ_0005870在高血壓患者血漿中的表達(dá)明顯下調(diào)，提示其可能是診斷高血壓的一種新型生物標(biāo)志物。

在由左心室負(fù)荷增大引起的心室重構(gòu)的病理過程中，心肌細(xì)胞的總數(shù)是恒定的，心肌間質(zhì)蛋白質(zhì)合成增加，肌節(jié)致密重組，導(dǎo)致心肌細(xì)胞重構(gòu)和心功能下降［17]。Zhou等［18]使用 circRNA 芯片篩查糖尿病db/db小鼠心肌中circRNAs表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了24個上調(diào)和19個下調(diào)的circRNAs。在體外實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)circRNA_010567顯著上調(diào)，生物信息學(xué)分預(yù)測circRNA_010567可吸附并抑制miR－141的功能，并通過雙熒光素酶法測定驗(yàn) 功能實(shí)驗(yàn)表明，沉默circRNA_010567的功能可上調(diào)miR－141，進(jìn)而下調(diào)TGF－β1表達(dá)，并抑制纖維化相關(guān)蛋白α－SMA/ColⅠ/ColⅢ的表達(dá)。該研究表明，circRNAs通過circRNA－miRNA－mRNA通路在糖尿病小鼠模型心肌纖維化過程中有重要作用。Jakobi等［19]運(yùn)用二代環(huán)狀測序技術(shù)和DCC軟件對鼠科動物的心臟組織 circRNAs進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn) Dmd－circRNA、Ryr2－circRNA、Ttn－circRNA可能直接或者間接影響相關(guān)的心血管疾病如擴(kuò)張型心肌病、右室心肌病、心肌肥厚等的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，觀察組共存在158個差異表達(dá)circRNAs。158個差異表達(dá)的circRNAs中105個表達(dá)下調(diào)、53個表達(dá)上調(diào)。158個circRNAs中FC＞5的有21個，表明差異表達(dá)的circRNA可能參與了左心室增大病理過程的調(diào)控。

miR－233是一種可以誘導(dǎo)心肌肥大的內(nèi)源性調(diào)節(jié)子，它可以受多種細(xì)胞因子調(diào)控，并調(diào)控下游的細(xì)胞因子，提高心肌細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝能力，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大［4，6，7]。含胱冬肽酶富集功能域的凋亡抑制因子(ARC)是其下游的作用靶點(diǎn)，ARC蛋白是20世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)的在心肌、骨骼肌和大腦等終末分化組織中大量表達(dá)的抗凋亡蛋白，在心肌內(nèi)表達(dá)可以起到防止心肌肥大和心肌細(xì)胞凋亡的作用。Wang等［20]通過建立的老鼠心衰模型，并發(fā)現(xiàn)mm9－circ－012559在心衰老鼠的心臟中含量顯著降低，于是將其稱為心臟相關(guān)性環(huán)狀 RNA(HRCR)，HRCR可以直接結(jié)合 miR－223并充當(dāng)內(nèi)源性的miR－233吸附海綿，抑制 miR－223表達(dá)、上調(diào)ARC表達(dá)。因此，可以通過HRCR －miR－233－ARC調(diào)控通路，抑制心肌細(xì)胞肥大，臨床表現(xiàn)上可起到阻止心臟增大和心力衰竭的作用。在本研究中，發(fā)現(xiàn)與miR－233存在結(jié)合位點(diǎn)的差異表達(dá)的circRNA 有 hsa_circRNA_102898、hsa_circRNA_101661、hsa_circRNA_103740。本研究推測這些circRNA可能通過靶向吸附miRNA－233來調(diào)控左心室增大病理過程。

綜上所述，與主動脈瓣反流無左心室增大患者比較，主動脈瓣反流合并左心室增大患者外周血存在158個差異表達(dá) circRNAs，hsa_circRNA_103245、hsa_circRNA_104014、hsa_circRNA_102617、hsa_circRNA_103421等21個circRNAs表達(dá)譜有顯著差異。158個circRNAs中105個表達(dá)下調(diào)、53個表達(dá)上調(diào)。158個差異表達(dá)circRNAs可能與主動脈瓣反流合并左心室增大的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。.hsa_circRNA_102898、hsa_circRNA_101661、hsa_circRNA_103740可能通過與miRNA－233位點(diǎn)結(jié)合調(diào)控左心室增大。由于本篩選研究納入標(biāo)本數(shù)量較少，有一定的局限性，還需要大樣本的臨床驗(yàn)證研究、后期做circRNA與miRNA吸附機(jī)制研究及PCR擴(kuò)增驗(yàn)證來進(jìn)一步研究加以證實(shí)，進(jìn)一步探討目標(biāo)circRNA與左心室增大的關(guān)系，深入研究目標(biāo)circRNA參與左心室增大病理過程的作用機(jī)制。