血管緊張素Ⅱ誘導高血壓大鼠腸系膜動脈PP2A激活的機制研究*

于 敏， 姜君財， 駱妍蓓， 張 倩， 丁 菁， 陸德琴

(貴州醫(yī)科大學病理生理學教研室， 貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550025)

高血壓是一種以體循環(huán)動脈血壓升高為主要特點的臨床綜合征，可導致腦卒中、腎衰竭及心力衰竭等嚴重并發(fā)癥。高血壓的發(fā)病機制復雜，其中腎素-血管緊張素系統(tǒng) (rennin-angiotensin system, RAS) 的異常激活被認為是其重要的發(fā)病機制之一[1]。血管緊張素Ⅱ (angiotensinⅡ, AngⅡ) 是RAS的主要組成部分，可通過與其1型受體 (AngⅡ type 1 receptor，AT1R) 結合參與多種心血管疾病的發(fā)生[2-3]。有研究報道， AngⅡ的慢性升高可導致內皮型一氧化氮合酶 (endothelial nitric oxide synthase, eNOS) 活性降低以及一氧化氮 (nitric oxide, NO) 生成減少，進而引起血管內皮功能障礙 (vascular endothelial dysfunction, VED) 和高血壓的發(fā)生[2,4]。生理條件下，血管壁的NO主要由內皮細胞的eNOS催化生成[5-6]，eNOS/NO功能障礙是心血管疾病發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)。eNOS的活性調節(jié)復雜，蛋白質翻譯后磷酸化調控是其活性調節(jié)的重要機制之一，eNOS Ser1177是其中一個重要的磷酸化位點，該位點磷酸化水平上調可增強eNOS活性[7]。

蛋白磷酸酶2A (protein phosphatase 2A，PP2A) 是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，其通過使蛋白質發(fā)生可逆性去磷酸化，在細胞信號轉導、細胞分化和DNA復制等多種生物學事件中發(fā)揮調控作用[8]。文獻報道，PP2A可使eNOS Ser1177去磷酸化而下調eNOS活性[9-10]。AngⅡ是激活PP2A的多種因素之一。研究表明，AngⅡ與心肌細胞膜上AT1R結合后可介導PP2A激活，進而使心肌細胞翻譯延長因子2去磷酸化，調控細胞內蛋白質的合成和心肌肥大[11]。本課題組前期研究[12-13]也觀察到雙腎單夾 (two-kidney one-clip, 2K1C) 腎血管性高血壓大鼠血清AngⅡ含量升高，腸系膜動脈PP2A活性增加、eNOS Ser1177磷酸化水平下調、eNOS活性降低及NO生成減少，并且利用PP1/PP2A抑制劑岡田酸 (okadaic acid，OA) 以及AT1R阻滯劑坎地沙坦 (candesartan，CAN) 均可逆轉上述現(xiàn)象，表明AngⅡ/AT1R通路可激活PP2A，降低eNOS活性。但是，AngⅡ激活血管內皮細胞PP2A，進而導致內皮功能障礙的分子機制目前仍不清楚。因此，本研究利用微量滲透泵持續(xù)灌注AngⅡ的方法構建高血壓大鼠模型，從動物整體水平探討AngⅡ/AT1R通路激活腸系膜動脈PP2A的分子機制，以期為臨床防治與AngⅡ密切相關的心血管疾病提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

清潔級雄性6周齡Sprague-Dawley (SD)大鼠40只，體重160～200 g，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK (黔) 2012-0001。本研究的動物實驗方案經(jīng)貴州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準。

2 實驗試劑與儀器

3 方法

3.1高血壓大鼠模型復制方法及實驗分組 大鼠常規(guī)適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照(control)組 (n=10)、AngⅡ組 (n=10)、CAN+AngⅡ組 (n=10)和CAN組 (n=10)。高血壓大鼠模型復制方法簡單描述如下：腹腔注射3%戊巴比妥鈉 (1 mL·kg-1)麻醉后，行頸背部皮膚橫切口，在皮下埋置預先嚴格按照產(chǎn)品說明書充填AngⅡ或生理鹽水的微量滲透泵，然后用手術絲線縫合切口，所有操作均按照外科無菌術原則。AngⅡ組及CAN+AngⅡ組埋置AngⅡ微量滲透泵 (500 ng·kg-1·min-1)，control組及CAN組埋置生理鹽水微量滲透泵 (500 ng·kg-1·min-1)。CAN+AngⅡ組與CAN組于皮下埋泵術后第1天給予坎地沙坦酯 (10 mg·kg-1·d-1) 灌胃，control組和AngⅡ組給予等量生理鹽水灌胃。各組大鼠均以普通飼料、自由飲水喂養(yǎng)14 d。

3.2血壓測量及高血壓判定 采用BP-300A大鼠無創(chuàng)血壓測量儀測定大鼠清醒狀態(tài)下尾動脈收縮壓，測量時間為埋置微量滲透泵前及埋置后3 d、7 d和14 d。每次測量均連續(xù)測6次，去掉最高值及最低值，取其余數(shù)值的平均值為當天收縮壓值。血壓在85～120 mmHg范圍為正常血壓大鼠，凡術后血壓比自身術前血壓升高≥30 mmHg者判定為高血壓。

3.3標本收集

3.3.1分離血清 SD大鼠取材前禁食10 h，用3%戊巴比妥鈉 (1 mL·kg-1) 腹腔麻醉后股動脈放血，留取血液至15 mL離心管中，于4℃靜置30 min后，4 ℃、3 000×g離心15 min，取上清，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3.2分離腸系膜動脈 取血后迅速剪開大鼠腹腔，于心臟未停止搏動前沿腸管壁剪取腸系膜組織，置于預冷的無菌PBS中，輕柔地將血管外脂肪、結締組織剝離后留取腸系膜動脈血管，迅速放入液氮中冷凍，用錫箔紙包裝冷凍后的動脈，置-80 ℃保存待用。

3.4血清AngⅡ含量測定 取-80 ℃保存的各組大鼠血清，置常溫下解凍后混勻備用。嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，用酶標儀在 450 nm 波長下讀取吸光度 (A) 值，并根據(jù)標準曲線計算各樣本AngⅡ含量。

3.5Western blot檢測蛋白水平 取-80 ℃保存的腸系膜動脈組織，稱重后加液氮研磨至細粉末狀，加入蛋白裂解液 (1 mL/g) 混勻后于冰上裂解45 min，超聲波破碎3次后，4 ℃、 12 000×g離心15 min，取上清液，BCA法測定樣品總蛋白濃度后，加入3×上樣緩沖液煮沸變性。經(jīng)10% SDS-PAGE分離，蛋白質轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗膜后分別加入相應I抗，4℃孵育過夜。次日，洗膜后加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，ECL顯影，于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)曝光。曝光后的條帶用Image Lab圖像分析軟件進行分析，以β-tubulin為內參照。

3.6PP2A酶活性檢測 取-80 ℃保存的腸系膜動脈組織，稱重后加液氮研磨至細粉末狀，加入預冷的磷酸酶貯存緩沖液后冰上裂解45 min，4℃、 12 000×g離心45 min，取250 μL上清液，將上清液過柱后收集濾出液， 嚴格按照PP2A檢測試劑盒說明書操作進行檢測。用酶標儀在600 nm波長處測定吸光度 (A) 值，根據(jù)標準曲線計算樣品PP2A的酶活性。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差 (mean±SD) 表示，組間比較采用單因素方差分析 (one-way ANOVA)。相關性分析采用Pearson相關分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 各組收縮壓變化

與control組及自身術前相比，AngⅡ組大鼠術后第3天收縮壓顯著升高 (P<0.05)，第7天收縮壓進一步升高 (P<0.05)，第14天在高水平持續(xù)(P<0.05)；與AngⅡ組比較，CAN+AngII組大鼠收縮壓顯著降低 (P<0.05)；control組、CAN組及CAN+AngⅡ組大鼠手術前后收縮壓以及各組間收縮壓差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 各組收縮壓的變化

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsbefore minipump implantation;△P<0.05vs3 d after minipump implantation;▲P<0.05vsAngⅡ group.

2 血清AngⅡ含量

與control組相比，AngⅡ組和CAN+AngⅡ組血清中AngⅡ含量均顯著升高 (P<0.05)，CAN組血清中AngⅡ含量差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 各組血清AngⅡ含量變化

Table 2. The changes of serum AngⅡ in each group (ng/L. Mean±SD.n=6)

GroupAng ⅡControl15.02±3.07AngⅡ18.42±2.07?CAN+AngⅡ17.70±3.99?CAN14.07±2.72

*P<0.05vscontrol group.

3 腸系膜動脈eNOS蛋白表達及eNOS Ser1177磷酸化水平

與control組相比，AngⅡ組腸系膜動脈eNOS Ser1177磷酸化水平顯著降低 (P<0.05)，其余兩組差異無統(tǒng)計學意義；與AngⅡ組相比，CAN+AngⅡ組eNOS Ser1177磷酸化水平顯著上調 (P<0.05)；各組間eNOS蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，見圖1。

4 腸系膜動脈PP2A活性

與control組相比，AngⅡ組腸系膜動脈PP2A活性顯著增高 (P<0.05)，其余兩組差異無統(tǒng)計學意義；與AngⅡ組相比，CAN+AngⅡ組PP2A活性顯著降低 (P<0.05)，見圖2。

5 PP2A活性與eNOS Ser1177磷酸化水平相關性分析

Pearson相關性分析顯示，PP2A活性變化與eNOS Ser1177磷酸化水平改變呈負相關，相關系數(shù)為r=-0.842 (P<0.05)。

6 腸系膜動脈PP2Ac Tyr307磷酸化水平和蛋白表達

Figure 1. The protein levels of eNOS and p-eNOS (Ser1177) in the mesenteric arteries of AngⅡ-induced hypertensive rats and the blocking effect of CAN. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡgroup.

圖1 各組大鼠腸系膜動脈eNOS蛋白表達及eNOS Ser1177磷酸化水平的變化

Figure 2. PP2A activity in the mesenteric arteries of AngⅡ-induced hypertensive rats and the blocking effect of CAN. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡgroup.

圖2 各組大鼠腸系膜動脈PP2A活性變化

Figure 3. The protein levels of PP2Ac and p-PP2Ac (Tyr307) in the mesenteric arteries of AngⅡ-induced hypertensive rats and the blocking effect of CAN. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡgroup.

圖3 各組大鼠腸系膜動脈PP2Ac表達和PP2Ac Tyr307磷酸化水平

討 論

腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活是導致高血壓的主要機制之一[14]，AngⅡ作為該系統(tǒng)中最為關鍵的血管活性物質，參與血流動力學和機體水鈉平衡調節(jié)[2-3]。RAS長期激活，尤其是AngⅡ濃度增加可導致原發(fā)性高血壓的發(fā)生[15]。在自發(fā)性高血壓大鼠[16]和腎血管性高血壓動物模型[17]中均存在RAS激活、血清和 (或) 組織中AngⅡ水平增高。本研究使用微量滲透泵持續(xù)灌注AngⅡ的方法復制高血壓大鼠模型，并檢測了各組血清中AngⅡ含量，觀察到在持續(xù)灌注AngⅡ后，大鼠血清中AngⅡ含量顯著升高，且血壓升高超過術前30 mmHg以上，提示AngⅡ誘導的高血壓大鼠模型復制成功。CAN灌胃治療顯著降低AngⅡ所致的高血壓，表明在高血壓形成過程中增高的AngⅡ通過與AT1R結合使血管發(fā)生收縮導致血壓升高，給予CAN灌胃治療可拮抗AT1R發(fā)揮顯著降壓作用。

血管內皮功能障礙是多種心血管疾病發(fā)病的共同始動因素，eNOS活性降低導致內皮細胞產(chǎn)生NO減少是引起內皮功能障礙的關鍵環(huán)節(jié)[18]。eNOS的活性調控涉及基因轉錄、蛋白質翻譯和翻譯后修飾等過程，磷酸化和去磷酸化調控是eNOS蛋白質翻譯后修飾的重要機制之一，Ser1177位點磷酸化可顯著上調eNOS活性[7]。AngⅡ是引起eNOS Ser1177降低的一個重要因素。已有研究表明，AngⅡ可下調人主動脈內皮細胞eNOS Ser1177磷酸化水平，減少NO的產(chǎn)生，其作用是通過AT1R通路所介導[19]。在動物整體水平研究中同樣觀察到，高鹽性高血壓大鼠主動脈eNOS Ser1177磷酸化水平下降，給予AT1R阻滯劑CAN治療后顯著增高eNOS Ser1177磷酸化水平，增加NO合成[20]；糖尿病小鼠主動脈eNOS Ser1177磷酸化水平下調，AT1R阻滯劑阿奇沙坦可上調eNOS Ser1177磷酸化水平，改善內皮功能[21]。本研究也觀察到AngⅡ誘導的高血壓大鼠腸系膜動脈eNOS Ser1177磷酸化水平顯著下調，而CAN顯著逆轉該效應。這些均提示AngⅡ通過AT1R通路顯著下調eNOS Ser1177的磷酸化水平，本文進一步研究其分子機制。

既往研究已證實，PP2A參與eNOS Ser1177去磷酸化調節(jié)[9-10]。在本課題組前期研究中已檢測到2K1C高血壓大鼠腸系膜動脈eNOS Ser1177發(fā)生去磷酸化、PP2A活性增高，是由AngⅡ/AT1R 通路介導[12]，繼續(xù)用大鼠腸系膜動脈進行離體水平研究，顯示20 nmol/L OA可顯著抑制AngⅡ誘導的eNOS Ser1177下調，進一步驗證了AngⅡ所介導的eNOS Ser1177下調是因PP2A的激活而引起[13]。本研究檢測到AngⅡ誘導大鼠腸系膜動脈PP2A活性顯著增高，通過分析PP2A活性與eNOS Ser1177磷酸化水平的相關性，結果表明二者呈負相關， 提示AngⅡ誘導的高血壓大鼠腸系膜動脈eNOS Ser1177磷酸化水平下調也是由于AngⅡ/AT1R通路激活PP2A所致。