基于化學計量學優(yōu)選不同制法山楂葉提取物

趙勝男，姚建伶，韓 笑，潘海峰?

（1.河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室／承德醫(yī)學院中藥研究所，河北 承德 067000；2.北京四環(huán)制藥有限公司，北京 100025；3.承德護理職業(yè)學院，河北 承德 067000）

化學計量學是一門通過數(shù)學或統(tǒng)計學方法將對化學體系的測量值與體系的狀態(tài)之間建立聯(lián)系的學科，它的特點是可以最有效地獲取體系有用的特征數(shù)據(jù)，并通過解析測量數(shù)據(jù)最大限度地從中提取有關(guān)物質(zhì)的定性、定量、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等信息［1］。化學計量學不僅在數(shù)學領(lǐng)域應用廣泛，在中藥鑒別、質(zhì)量控制等研究中也越來越被接受和使用［2-9］。本研究運用化學計量學對不同采集地山楂葉藥材中采用面積歸一化法所得15 種成分的峰面積比例進行統(tǒng)計；應用聚類分析與主成分分析得到30 批藥材；利用判別分析建立質(zhì)量數(shù)學表達式。

山楂葉具有活血化瘀、化濁降脂等功效，主要含有黃酮和有機酸類。其臨床制劑品種很多，如山玫膠囊［10］、心安膠囊［11］、益心酮片［11］等，主要用于心腦血管方面疾病的治療；近幾年，對活血化瘀藥物與血瘀證的相關(guān)研究已經(jīng)成為現(xiàn)代學者主要領(lǐng)域之一。大量研究表明，血瘀證的發(fā)生與粘滯性異常和血液流變等生理病理改變有關(guān)，而其中的宏觀流變學主要研究血液在不同切變率下的黏度表現(xiàn)［12］。本研究在選用符合上述質(zhì)量數(shù)學表達式要求的藥材基礎(chǔ)上，同時選取的提取工藝以《中國藥典》和成方制劑為準則，以最大限度得到黃酮類成分的提取思路為模型作用于血瘀模型大鼠，以全血黏度值為指標，在藥材質(zhì)量可追溯的基礎(chǔ)上結(jié)合大鼠全血黏度值優(yōu)選最佳山楂葉提取物制法，方法科學、更具有實用意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 安捷倫1200 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；AG-245 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；LBY-N6K 型全自動血流變儀（北京市普利生儀器有限公司）；KQ700 型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 動物 Wistar 雄性SPF 級大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購于北京市維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2012-0001。

1.3 試劑 金絲桃苷（批號111521-200303），購于中國食品藥品檢定研究院；牡荊素鼠李糖苷（批號151024）、牡荊素葡萄糖苷（批號151103），購于上海融禾有限公司，上述對照品含有量≥98%。烏拉坦（20150401），購于天津光復精細化工研究所；鹽酸腎上腺素（批號1505301），購于天津市金耀藥業(yè)有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，購于美國Fisher 公司；水為娃哈哈純凈水；其他試劑為分析純。

1.4 試藥 山楂葉為薔薇科植物山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥葉，由承德民族師范學院董建新教授鑒定為正品，具體見表1。山楂葉制法A［10］（模擬山楂葉成藥山玫膠囊，山楂葉以50%乙醇為提取液）、山楂葉制法B（山楂葉藥材加5 倍量50%乙醇，加熱回流提取2 次，合并提取液用3 倍量水飽和正丁醇溶液提取3 次，合并的正丁醇提取液濃縮至干，即得）、山楂葉制法C［11］（模擬山楂葉成藥益心酮片，以山楂葉提取物D 為原料制成制劑）、山楂葉制法D（50%乙醇提取液，通過收集大孔吸附樹脂柱不同體積分數(shù)乙醇洗脫液，回收乙醇得清膏）。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 法建立

2.1.1 色譜條件［13］Aglient Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）-四氫呋喃（C）；梯度洗脫（0～5 min，10%～12% B；5～15 min，12%B；15～20 min，12%B，前20 minC 占0。20～23 min，12%～14% B；23～35 min，14% B；35～40 min，14%～20% B；40～50 min，20%～30% B；50～60 min，30%～60%B；60～65 min，60%～80%B，20 min 以后C 占8%）；檢測波長320 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取山楂葉D（2015 年版《中國藥典》方法）約0.05 g，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密移取60%甲醇25 mL，精密稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，待冷卻后補足減失質(zhì)量，上清液以0.45 μm 微孔有機濾膜過濾，即得。

2.1.3 對照品溶液制備 精密稱取金絲桃苷15.5 mg、牡荊素葡萄糖苷22.0 mg、牡荊素鼠李糖苷20.0 mg，置50 mL棕色量瓶中，甲醇溶劑定容，即得（質(zhì)量濃度分別為0.31、0.44、0.40 mg／mL），密封備用。

2.1.4 樣品測定方法 按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項條件下進樣，色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度試驗 取“2.1.3”項下混合對照品溶液適量，在“2.1.1”項條件下連續(xù)進樣測定6 次，測得金絲桃苷、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷峰面積RSD 分別為1.88%、1.06%、0.95%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（24號）適量，在“2.1.1”項條件下于0、2、4、8、12、24 h測定，測得金絲桃苷、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷峰面積RSD 分別為1.45%、1.04%、0.78%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 重復性試驗 取同一批樣品（24 號）適量，按“2.1.2”項 下 方 法 制 備 供 試 品 溶 液，平 行6 份，在“2.1.1”項條件下進樣，測得金絲桃苷、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷峰面積RSD 分別為1.49%、0.88%、0.52%，表明該方法重復性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗 取同一批樣品（24 號）適量，分別加入一定量的金絲桃苷、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液6 份，在“2.1.1”項條件下進樣，測得金絲桃苷、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷加樣回收率分別為99.43%、99.66%、99.80%，RSD 分 別 為2.20%、1.16%、0.51%，結(jié)果 與2015 版《中國藥典》標準符合。

2.3 主成分分析 采用SPSS19.0 軟件中的因子分析，以降維思想為指導，對應用面積歸一化法獲得的不同采集地山楂葉中15 個成分的峰面積比例含有量進行處理。結(jié)果，前5 個成分的特征值均大于1，但總方差的累積貢獻率為72.879%，偏小，若提取前8 個成分，累積貢獻率可達87.279%＞85%，表明前8 個主成分才可反映不同批次山楂葉的質(zhì)量。再計算山楂葉藥材的主成分得分，見圖2，可知樣品分為2 類，其中1 號樣品處于2 類樣品區(qū)域的交界處，并不能明確歸類，為了保證山楂葉質(zhì)量，剔除該批樣品，所以9、11、21 及15～18 為Ⅰ類，其余30 批樣品聚為Ⅱ類，而且由于Ⅰ類樣品相對Ⅱ類樣品數(shù)目較少，分散，可當作質(zhì)量不穩(wěn)定樣品篩除，Ⅱ類樣品為優(yōu)質(zhì)山楂葉。

圖2 主成分得分圖

2.4 聚類分析 利用面積歸一化法將表1 山楂葉中金絲桃苷等15 種成分（色譜峰見圖1）的峰面積比例輸入SPSS19.0 軟件，采用組內(nèi)聯(lián)接法，同時以歐式距離為區(qū)間進行聚類分析，結(jié)果見圖3。當類間距在15～25 時，藥材被分為兩類。1、9、11、21 及15～18 為Ⅰ類，其余30 批為Ⅱ類。

2.5 判別分析 應用SPSS19.0 軟件中分類判別，利用貝葉斯判別函數(shù)系數(shù)法對Ⅱ類藥材建立矩陣，表達式為Y=-16.241+0.335X1+2.302X2+0.313X3+0.317X4+0.209X5+0.446X6+0.522X7+1.572X8+0.578X9+2.664X10+0.790X11-0.313X12-0.498X13+0.156X14-1.615X15，其中X1～X15分別代表圖1 中色譜峰1～15 的峰面積比例。把Ⅱ類藥材所有峰面積比例的平均值代入上述表達式，得Y值為14.611。當有未知質(zhì)量樣品的Y值范圍在90%～110%（13.15～16.08）之間時，此樣品質(zhì)量穩(wěn)定可靠，可作為供試品進行深入研究。

圖3 38 批樣品聚類樹狀圖

2.6 各制備方法提取物對血瘀模型大鼠全血黏度的測定方法建立

2.6.1 實驗動物分組及給藥 Wistar 大鼠（雄性）隨機分為15 組，每組8 只，分別為制備方法A、B、C、D 的高、中、低劑量組，模型組，空白組。各給藥組灌胃給予相應劑量藥物，均用同樣體積的0.5% 羧甲基纖維素鈉溶液溶解，空白組與模型組平行處理，每天給藥1 次，連續(xù)8 d。

2.6.2 血瘀模型大鼠建立 大鼠第7 天給藥后除空白組皮下注射給予生理鹽水外，其余組均頸背部皮下注射鹽酸腎上腺素，劑量為0.8 mg／kg，2 h 后除空白組外其余各組大鼠均浸入冰水中（4 ℃）5 min。冰浴結(jié)束2 h后，再次注射同劑量鹽酸腎上腺素。

2.6.3 指標測定與數(shù)據(jù)處理 第8 天給藥1 h 后取血，20%烏拉坦麻醉（5.0 mg／kg）后腹主動脈取血，取約4.0 mL加入有肝素鈉抗凝劑的EP 管中，全血使用全自動血流變儀測定全血黏度。計量數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計，對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2.6.4 不同制備方法的山楂葉對全血黏度的影響 與空白組比較，模型組高、中、低切變率全血黏度值均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，山楂葉A、B、C、D 高、中、低劑量組在不同切變率下對全血黏度值均有不同程度影響，其中D 在3 個切變率下各劑量全血黏度均顯著降低（P＜0.01）。見表2。

表2 不同制備方法山楂葉提取物對全血黏度的影響（mPa·s，±s）

表2 不同制備方法山楂葉提取物對全血黏度的影響（mPa·s，±s）

注：與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

3 討論

2015 年版《中國藥典》一部中，山楂葉質(zhì)量標準包括性狀鑒定、薄層色譜鑒別以及山楂葉總黃酮和金絲桃苷的測定。目前的質(zhì)量標準存在質(zhì)控指標單一，與藥效關(guān)聯(lián)性不強等問題。本研究在課題組成果-山楂葉指紋圖譜基礎(chǔ)上，以中藥多組分作用特點，盡可能多的選取色譜峰為研究目標，同時采用面積歸一化法測定了指標成分的比例值，面積歸一化法可體現(xiàn)每種成分所占總成分的含有量百分比，與中藥多組分、多靶點的作用特點相呼應。本實驗又利用化學計量學中聚類分析和主成分分析法，以指標成分比例值為分析目標，從不同采集地中排除安徽、廣東乳源、廣東南昆山、廣西桂林、廣西賀州、廣西梧州、廣西玉林及山東維安，最終剩余多個采集地的山楂葉質(zhì)量可靠、穩(wěn)定。篩選出的山楂葉樣品采用判別分析，建立了質(zhì)量數(shù)學表達式，如有未知質(zhì)量的山楂葉樣品，可把每個色譜峰面積比例值直接帶入數(shù)學式中，當Y值范圍在13.15～16.08 時，未知山楂葉質(zhì)量符合要求，該藥材質(zhì)量評價的方法簡便、可靠。

本實驗在優(yōu)選出山楂葉藥材基礎(chǔ)上，以活血化瘀藥效實驗對不同制備方法的山楂葉提取物進行評價。本研究所選取的4 種制備方法山楂葉提取物通過血瘀模型大鼠全血黏度值變化，最終確定4 種制備方法山楂葉提取物均對大鼠全血黏度有不同程度的作用。但是綜合不同制法的高、中、低濃度作用于大鼠全血黏度，制備方法D 在低濃度就有顯著性差異，而且在不同切變率下均具有顯著性差異，最終制備方法D 在全血黏度這項指標上效果更加明顯，與活血化瘀作用關(guān)聯(lián)度更加緊密，更加具有實用意義，為最優(yōu)制備方法提取物。

本研究既保證活血化瘀藥效試驗樣本質(zhì)量的可追溯性，又以藥效試驗評價山楂葉制備方法，即篩選優(yōu)良藥材-建立質(zhì)量數(shù)學表達式-符合質(zhì)量要求藥材進行主要藥效學試驗-最優(yōu)提取物制備方法選擇。