舒心通脈顆粒提取工藝的優(yōu)化

周 泉，王晗雪，李素麗，張慧倩，李國文，程雪梅，陳 穎?，王長虹?

（1.上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200082；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，上海市復(fù)方中藥重點實驗室，上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，上海 201203）

舒心通脈方是臨床用于治療慢性心衰達(dá)數(shù)十年之久的院內(nèi)制劑，由炮附子、干姜、白術(shù)、黃芪、蒲黃5 味藥材組成［1］，取附子辛熱之性，溫補心腎之陽，通行血脈；輔以干姜，以溫通全身陽氣；益以白術(shù)、黃芪、蒲黃，化瘀而不傷正，諸藥相伍，以達(dá)舒心通脈、益氣活血之效。本方臨床應(yīng)用時劑型為水煎劑，存在使用不便等缺點，故有必要在傳統(tǒng)湯劑的基礎(chǔ)上研制成顆粒劑、片劑或膠囊劑等固體劑型，以便于臨床使用。

提取工藝試驗設(shè)計方法主要有均勻設(shè)計、正交試驗設(shè)計，但均存在精度不夠、模型預(yù)測性較差等缺點，而且取值僅僅是接近最佳取值，無法精確到最佳點，不能靈敏地考察各因素之間的交互作用等缺陷［2］。鑒于此，近年來常用集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法于一體的星點設(shè)計-響應(yīng)面法進(jìn)行設(shè)計，具有試驗次數(shù)少、精度高等特點，在藥學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［3］，并且大多采用多指標(biāo)評價體系權(quán)重賦分的方法［4］，它分為主觀賦權(quán)法和客觀賦權(quán)法［5］，前者中G1 法是對層次分析法（AHP）進(jìn)行改進(jìn)的主觀賦權(quán)法，具有計算速度快、無需一致性檢驗等優(yōu)點［6］，而后者中熵權(quán)法可與其他方法組合使用［7］，從而優(yōu)選出合理可行的提取工藝參數(shù)。因此，本實驗采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法結(jié)合G1-熵權(quán)法優(yōu)化舒心通脈顆粒提取工藝，為該制劑臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

Waters e2695 HPLC 色譜儀（配置四元泵、Waters 2998紫外檢測器、柱溫箱，美國Waters 公司）；EYELAN-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本Rikakikai 公司）；BSA124S-CW 電子分析天平（萬分之一）、BT25S 電子分析天平（十萬分之一）［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；ZNHW 電熱套（上海羌強儀器設(shè)備有限公司）。毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號130030-201801，含有量98%）、香蒲新苷（批號240012-201805，含有量98%）、異鼠李素-3-O-新橙皮苷（批號250069-201801，含有量98%）對照品均購于上海鴻永生物科技有限公司；6-姜辣素對照品（批號Y11J9H65403，含有量98%）購于上海源葉生物科技有限公司。炮附子、干姜、白術(shù)、黃芪、蒲黃飲片均購于上?？禈蛑兴庯嬈荆?jīng)上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心吳立宏研究員鑒定為正品。甲醇、磷酸為色譜純（美國Fisher 公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含有量測定

2.1.1 色譜條件 BostonC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）-0.5% 磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，35% A；15～22 min，35%～45% A；22～45 min，45%～95% A）；檢測波長254 nm（0～30 min）、280 nm（30～45 min）；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL／min；進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.1.2 供試品溶液液制備 按處方量精密稱取炮附子（黑順片）適量，加5 倍量水，先煎1.5 h，其余4 味藥材加入上述藥液，再加5 倍量水煎煮45 min，合并，濃縮至密度為1.01 g／mL，精密量取適量，濃縮4 倍，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，70%甲醇制成每1 mL 分別含毛蕊異黃酮葡萄糖苷95.0 μg、香蒲新苷94.6 μg、異鼠李素-3-O-新橙皮苷85.0 μg、6-姜辣素93.2 μg 的溶液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 取“2.1.3”項下對照品溶液，稀釋后搖勻，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣20 μL 測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、6-姜辣素方程分別為Y=63 270X+19 036（r=0.999 9）、Y=29 920X+805.66（r=1）、Y=35 150X-1 764.3（r=0.999 9）、Y=11 006X+3 967（r=0.999 9），分別 在0.475～95.0、2.37～94.6、2.13～85.0、4.66～93.2 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗 取高（66.5、66.2、59.5、65.2 μg／mL）、中（47.5、47.3、42.5、46.6 μg／mL）、低（28.5、28.4、25.5、28.0 μg／mL）質(zhì)量濃度對照品溶液，同1 d 內(nèi)在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、6-姜辣素峰面積RSD 分別為高（0.11%、0.49%、0.42%、0.09%）、中（0.36%、0.28%、0.58%、1.53%）、低（0.34%、0.64%、0.44%、0.39%），表明儀器日內(nèi)精密度良好；連續(xù)測定3 d，測得各成分峰面積RSD 分別為高（0.67%、0.79%、0.85%、0.94%）、中（0.60%、0.38%、1.03%、1.64%）、低（0.39%、0.57%、1.56%、0.76%），表明儀器日間精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 精密量取供試品貯備液100 mL，按“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、6-姜辣素含有量RSD 分別為1.31%、0.86%、1.02%、1.92%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、6-姜辣素峰面積RSD 分別1.14%、1.02%、0.67%、0.30%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密量取“2.1.2”項下含有量已知的供試品溶液20 mL，置于50 mL 量瓶中，加入50%、100%、150%水平的對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、6-姜辣素平均加樣回收率分別為97.29%、99.80%、96.65%、101.52%，RSD分別為1.01%、1.80%、1.15%、1.79%。

2.2 評價指標(biāo)組合賦權(quán)

2.2.1 G1 法主觀賦權(quán)［6］。步驟1：確定各指標(biāo)順序關(guān)系，設(shè)同級評價指標(biāo)為｛x1，x2，…，xm｝，確定順序關(guān)系。步驟2：設(shè)xk-1與xk的重要程度之比的相對重要程度記為rk，且（k=m，m-1，…，2）。步驟3：計算權(quán)重系數(shù)公式為、wk-1=rkwk（k=m，m-1，……，2）。

2.2.2 熵權(quán)法客觀賦權(quán) 步驟1：原始數(shù)據(jù)矩陣歸一化，設(shè)m個評價指標(biāo)、n個評價對象的原始數(shù)據(jù)矩陣為X=（xij）n×m，對其歸一化后得到屬性矩陣R=（rij）n×m，對效益型屬性（指屬性值愈大愈好的指標(biāo)）而言，進(jìn)行歸一化［9］，公式為rij=（xij -xmin）／（xjmax-xjmin），其中xij為第i個評價對象的第j項指標(biāo)數(shù)據(jù)，xjmax、xjmin分別為xij的最大值、最小值，i=1，2，…，n；j=1，2，…，m。步驟2：求取指標(biāo)熵值［10］，公 式 為，k=1／lnn，當(dāng)fij=0 時，xijlnn=0。步驟3：計算指標(biāo)信息權(quán)重［10］，公式為。

2.2.3 組合權(quán)重確定 設(shè)定由G1 法得到的主觀權(quán)重為w1，熵權(quán)法得到的客觀權(quán)重為w2，組合權(quán)重wj計算公式為。依據(jù)復(fù)方“君臣佐使”配伍原則及功效相關(guān)藥效物質(zhì)，由G1 法確定4 個評價指標(biāo)重要性依次為毛蕊異黃酮葡萄糖苷含有量＞干浸膏質(zhì)量＞6-姜辣素含有量=香蒲新苷+異鼠李素3-O-新橙皮苷含有量，權(quán)重評價標(biāo)度分別為r2=1.8、r3=1.4、r4=1.0，求得主觀權(quán)重值w1，再采用熵權(quán)法計算各指標(biāo)客觀權(quán)重值w2，然后計算組合權(quán)重值w和綜合評分，最后進(jìn)行直觀分析和方差分析，具體權(quán)重見表1。

2.3 星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化 選擇加水量（A）、提取時間（B）作為影響因素，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、6-姜辣素、香蒲新苷+異鼠李素-3-O-新橙皮苷含有量及浸膏得率作為影響指標(biāo)，每個因素設(shè)5 個水平，用-α、-1、0、1、α 來表示（α=1.414），因素水平見表2，結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表1 提取工藝評價指標(biāo)權(quán)重值

表2 因素水平

表3 試驗設(shè)計及結(jié)果

表4 方差分析

然后，通過Design-Expert 8.0.6 軟件得到多元線性方程Y1=43.990 67+3.640 34A+0.137 38B（r=0.794 2，P=0.006 9 ＜0.05）、二項式回歸方程Y2=-91.674 48+22.946 59A+2.070 35B-0.047 417AB-0.858 62A2-0.016 209B2（r=0.924 5，P=0.007 6＜0.05），可知后者相關(guān)系數(shù)較大，擬合效果較好，可用于分析預(yù)測。由表4 可知，各因素影響程度依次為A＞B，A 有顯著性影響（P＜0.01），響應(yīng)面分析見圖2。由此確定，最優(yōu)提取工藝為加水量12.17 倍，煎煮時間45.67 min，預(yù)測評分94.81，考慮到實際生產(chǎn)需要，將其修正為加水量12 倍，煎煮時間45 min。

圖2 各因素響應(yīng)面圖

2.4 提取次數(shù)考察 固定加水量為12 倍，提取時間為45 min，分別提取1、2、3 次，進(jìn)行綜合評分，結(jié)果見表5。由表可知，提取2 次時已達(dá)到3 次的84%，故從資源成本、生產(chǎn)情況角度考慮，選擇2 次作為提取次數(shù)。

表5 提取次數(shù)考察結(jié)果

2.5 驗證試驗 按照優(yōu)化工藝［炮附子加6 倍量水先煎1.5 h，其余4 味藥材（干姜、白術(shù)、黃芪、蒲黃）倒進(jìn)上述藥液，加6 倍量水煎煮45 min，濾過，藥渣加12 倍量水煎煮45 min，濾過，合并濾液，濃縮至密度為1.01 g／mL］進(jìn)行3 批驗證試驗，結(jié)果見表6，可知工藝合理可行，重復(fù)性、預(yù)測性良好。

表6 驗證試驗結(jié)果（n=3）

3 討論

2015 年版《中國藥典》中明確記載，附子味辛、甘，大熱，有毒，用量3～15 g，需先煎、久煎。文獻(xiàn)［11-16］報道，附子中雙酯型生物堿毒性極大，容易導(dǎo)致人體中毒，但在加熱過程中會轉(zhuǎn)化成單酯型生物堿，從而降低毒性，故本實驗采用炮附子（即藥典收錄品種黑順片）。藥典規(guī)定，附片中含雙酯型生物堿以新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿總量計，不得超過0.010%，苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿總量不得少于0.010%。在工藝考察中，由于水煎液無法濃縮與藥典規(guī)定一致的質(zhì)量濃度，低于檢測限，無法將其納入工藝考察指標(biāo)內(nèi)，故未改變其先煎時間，仍按照原工藝先煎1.5 h。

本實驗選擇毛蕊異黃酮葡萄糖苷、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、6-姜辣素含有量作為指標(biāo)成分，與2015年版《中國藥典》一致，而且它們轉(zhuǎn)移到水煎液中時可達(dá)到量質(zhì)傳遞過程的監(jiān)控，同時還對黃芪中毛蕊異黃酮進(jìn)行了指認(rèn)，但其含有量較低，對工藝優(yōu)化影響不大，故未納入考察指標(biāo)中。然后，以上述4 個成分含有量及浸膏得率為評價指標(biāo)，通過星點設(shè)計-響應(yīng)面法結(jié)合G1-熵權(quán)法對舒心通脈顆粒提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)與原工藝相比，最優(yōu)工藝在未降低提取效率的前提下用水量減半，既提高了生產(chǎn)效率，又產(chǎn)生了節(jié)約資源、保護(hù)環(huán)境的社會效益。由此可知，該方法科學(xué)合理，真實可靠，優(yōu)化工藝參數(shù)穩(wěn)定可控，有效成分得率較高，可為舒心通脈顆粒工業(yè)化生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。