強(qiáng)心顆粒對心氣虛兼血瘀水腫證心衰大鼠心肌細(xì)胞線粒體凋亡的影響

肖 軍 ，部 帥，李 珩，周 杰，呂林懋，林家茂?

（1.山東省腫瘤防治研究院內(nèi)科五病區(qū)，山東 濟(jì)南 250117；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管科，山東 濟(jì)南 250001；3.淄博市中心醫(yī)院中醫(yī)科，山東 淄博 255020；4.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院急診科，山東濟(jì)南 250012）

基于慢性心力衰竭心氣虛兼血瘀水腫證大鼠模型［1］（專利號ZL201410271759.3），前期實驗證實強(qiáng)心顆?？梢酝ㄟ^拮抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡改善模型大鼠的心功能及預(yù)后，Rac-1 蛋白可能是強(qiáng)心顆粒干預(yù)慢性心力衰竭心氣虛兼血瘀水腫證的重要蛋白靶標(biāo)［2-3］。本實驗根據(jù)上述結(jié)果提出假設(shè)，線粒體凋亡通路可能是強(qiáng)心顆粒調(diào)控模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制，并對此進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性SD 大鼠50 只，3～4 周齡，體質(zhì)量（200±15）g，購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁殖有限公司，動物生產(chǎn)合格證號SCXK（魯）2014-0007。動物飼養(yǎng)及觀察在山東省腫瘤防治研究院實驗中心進(jìn)行，每籠3～5 只，自然采光，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 試藥 強(qiáng)心顆粒組方藥材為黃芪、炒白術(shù)、干姜、水蛭、茯苓、車前子、枳實、葶藶子、炙甘草。取上述9 味藥材，加10 倍量水煎煮1 h，過濾，藥渣再加8 倍量水煎煮1 h，過濾，2 次藥液合并，減壓濃縮（70～80 ℃、-0.08～-0.07 MPa）至相對密度1.25～1.30 的稠膏，加適量糊精混合均勻，制成顆粒，60 ℃以下烘干，整粒，分裝，規(guī)格每袋9 g，每包12 袋，每袋相當(dāng)于原生藥材17.31 g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科制備提供。鹽酸阿霉素（ADM）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；丙基硫氧嘧啶（6-丙基-2-硫尿嘧啶，PTU）購自美國Sigma-Aldrich 公司；纈沙坦（VAL）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RIPA 裂解液（強(qiáng)）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞懸液制備（組織消化）試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-10）購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；組織ATP 測試試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Cyto-C、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bcl-2、Bax抗體購自美國Sigma-Aldrich 公司；GAPDH 抗體購自美國Sigma-Aldrich 公司。

1.3 儀器 正置熒光顯微鏡（型號Nikon 80i）購自日本尼康公司；流式細(xì)胞儀（型號FACS AriaⅡ）購自美國BD 公司；透射電子顯微鏡（型號JEOL-1200EⅪ）購自日本電子JEOL 公司。

2 方法

2.1 分組及給藥 按體質(zhì)量隨機(jī)選10 只大鼠作為正常組，其余40 只大鼠采用阿霉素聯(lián)合丙基硫氧嘧啶雙重因子攻擊技術(shù)復(fù)制成慢性心力衰竭心氣虛兼血瘀水腫證模型。造模結(jié)束時，正常組大鼠無死亡，模型組大鼠死亡5 只，存活成模大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組12 只、纈沙坦組11 只、強(qiáng)心顆粒組12 只，纈沙坦、強(qiáng)心顆粒均給予臨床等效劑量［3］，按照體表面積折算給藥量，纈沙坦以13.35 mg／kg劑量灌胃，強(qiáng)心顆粒以9.26 g／kg 劑量灌胃；正常組、模型組給予生理鹽水灌胃。將纈沙坦與強(qiáng)心顆粒分別溶于生理鹽水中，配制成質(zhì)量濃度為1.07 mg／mL 與0.74 g／mL 的混懸液，灌胃前渦旋儀充分混勻，給藥體積為12.5 mL／kg，共干預(yù)4 周。

2.2 心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 各組按體質(zhì)量隨機(jī)選取5 只大鼠，冰上快速取約1 mm3大鼠心尖部內(nèi)膜面心肌，2.5%戊二醛固定，1%鋨酸再固定，按標(biāo)準(zhǔn)流程逐級梯度酒精脫水，丙酮沖洗，環(huán)氧樹脂包埋固定，超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾和檸檬鉛電子染色，透射電鏡觀察、攝片［4-5］。

2.3 心肌細(xì)胞線粒體跨膜電位檢測 利用細(xì)胞懸液制備（組織消化）試劑盒提取心肌細(xì)胞，冰上將送檢電鏡剩余部分心肌組織剪成3 mm3小塊，漂洗后加入消化酶進(jìn)行消化，電磁攪拌棒振蕩，10%胎牛血清終止消化，細(xì)胞篩過濾后離心，棄上清，沉淀加入培養(yǎng)液，輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，顯微鏡計數(shù)。利用細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-10）檢測心肌線粒體跨膜電位，收集細(xì)胞1×106／Test，PBS 洗滌細(xì)胞2 次；吸取500 μL 1×Incubation Buffer，稀釋預(yù)熱至37 ℃，加入1 μL JC-10，渦旋混勻配成JC-10 工作液；取JC-10 工作液使細(xì)胞均勻懸浮后，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育15 min。離心收集細(xì)胞，洗滌2 次；吸取500 μL 1×Incubation Buffer 再次懸浮細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察。JC-10（Enhanced JC-1）是一種陽離子脂質(zhì)熒光染料，作為檢測跨膜電位的指示劑［6］，跨膜電位較高時，JC-10 紅色熒光；在跨膜電位較低時，JC-10 產(chǎn)生綠色熒光，并利用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步行定量分析。

2.4 心肌組織ATP 水平測定 低溫沖洗后切取剩余大鼠心臟，稱取100 mg 心肌組織，剩余組織于-80 ℃冰箱中保存，加入900 μL 煮沸雙蒸水制備成10%勻漿液，然后置于高溫沸水浴箱中10 min，反復(fù)混合搖勻，室溫、3 500 r／min 離心10 min，離心后抽取上清液，利用ATP 檢測試劑盒、可見分光光度計檢測心肌ATP 水平。

2.5 Western blot 從-80 ℃冰箱取出凍存心肌組織，經(jīng)RIPA 裂解液提取組織全蛋白，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白樣品濃度；加樣，蛋白10 μg／孔，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法于100 V 電泳1.5 h；采用0.22 μm 孔徑的PVDF 膜，制作三明治，200 mA 轉(zhuǎn)膜1 h；5%脫脂牛奶室溫封閉至少1 h；加入一抗。搖床4 ℃過夜孵育；第2 天洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜；ECL 發(fā)光液（1∶1 等比例）顯色，Image Pro-plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)對條帶豐度進(jìn)行分析。每組重復(fù)3 次。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理，計量資料以（±s）表示，若方差齊時，采用方差分析或t檢驗；若方差不齊時，采用Games-Howell檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 死亡率 治療期間，正常組未死亡，模型組死亡5 只（死亡率41.67%），纈沙坦組死亡2 只（死亡率18.18%），強(qiáng)心顆粒組死亡2 只（死亡率16.67%）。死亡大鼠解剖后，均發(fā)現(xiàn)肝臟淤血、腫大，大量腹腔積液，提示心力衰竭發(fā)生。

3.2 線粒體超微結(jié)構(gòu) 如圖1 所示，正常組心肌細(xì)胞內(nèi)肌原纖維排列規(guī)整，肌小節(jié)明、暗帶及Z線清晰，心肌線粒體排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰，線粒體嵴結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠肌原纖維排列紊亂，明、暗帶及Z 線難以分辨，心肌線粒體排列紊亂，線粒體明顯變形腫脹、聚集融合，內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，部分線粒體可見明顯空泡化，線粒體嵴結(jié)構(gòu)模糊不清，或斷裂、缺失；纈沙坦組心肌細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)改觀，肌原纖維明、暗帶及Z 線尚能分辨，線粒體腫脹、部分融合，結(jié)構(gòu)相對完整，線粒體嵴尚為清楚；強(qiáng)心顆粒組心肌細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)明顯改觀，肌原纖維明、暗帶及Z 線較為清晰，線粒體輕度腫脹，排列較整齊，線粒體嵴結(jié)構(gòu)較為清楚。

圖1 各組心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)（×15 000）Fig.1 Ultrastructures of mitochondria of cardiac muscle cells in various groups（×15 000）

3.3 線粒體跨膜電位下降心肌細(xì)胞比例 如圖2所示，流式細(xì)胞檢測與正常組比較，模型組線粒體跨膜電位下降心肌細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，纈沙坦組、強(qiáng)心顆粒組線粒體跨膜電位下降心肌細(xì)胞比例顯著減低（P＜0.01），以強(qiáng)心顆粒組更顯著（P＜0.01）。

3.4 心肌組織ATP 水平 心肌細(xì)胞在凋亡過程中，線粒體合成ATP 能力會顯著下降［7］。如圖3所示，與正常組比較，模型組心肌組織ATP 水平顯著減低（P＜0.01）；與模型組比較，纈沙坦組、強(qiáng)心顆粒組心肌組織ATP 水平顯著升高（P＜0.01），以強(qiáng)心顆粒組更顯著（P＜0.01）。

圖2 各組線粒體跨膜電位下降心肌細(xì)胞比例Fig.2 Proportions of myocardial cells with decreased mitochondrial transmembrane potential in various groups

圖3 各組心肌組織ATP 水平Fig.3 ATP levels in myocardial tissues in various groups

3.5 線粒體凋亡通路相關(guān)調(diào)控分子 Cyto-C 位于線粒體外膜和內(nèi)膜之間的空隙中，線粒體凋亡通路激 活時，Cyto-C 被釋放到細(xì)胞質(zhì)［7］。Cleavedcaspase-3、Cleaved-caspase-9 分別作為Caspase-3、Caspase-9 的活化形式，都屬于Caspase 家族，是線粒體凋亡通路的關(guān)鍵調(diào)控蛋白酶［8］。Bcl-2／Bax 比率直接決定了線粒體外膜各種通道的開放程度，形成線粒體凋亡通路的樞紐［9］。如圖4 所示，與正常組比較，模型組 Cyto-C、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9 蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2／Bax 比率顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，纈沙坦組和強(qiáng)心顆粒組Cyto-C、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9 蛋白表達(dá)顯著減低（P＜0.01），Bcl-2／Bax 顯著升高，以強(qiáng)心顆粒組更顯著（P＜0.01）。

圖4 各組心肌組織Cyto-C、Cl-caspase-3、Cl-caspase-9、Bcl-2／Bax 蛋白表達(dá)Fig.4 Expressions of Cyto-C，Cl-caspase-3，Cl-caspase-9 and Bcl-2／Bax protein in myocardial tissues in various groups

4 討論

心肌細(xì)胞凋亡是受基因精確調(diào)控的主動性、程序性細(xì)胞死亡（PCD）［10］，近年來心肌細(xì)胞凋亡在慢性心力衰竭的治療中越來越受到學(xué)者重視，已由原來的組織病理學(xué)特點逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樾牧λソ叩摹爸委熌繕?biāo)”［11］。前期實驗證實，拮抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是強(qiáng)心顆粒改善模型大鼠心功能及預(yù)后的重要機(jī)制［2-3］，而線粒體是氧化應(yīng)激的主要發(fā)生場所［7］，因此，本實驗進(jìn)一步探索強(qiáng)心顆粒對心肌細(xì)胞線粒體凋亡通路的調(diào)控作用。

線粒體凋亡通路是線粒體結(jié)構(gòu)、功能障礙以及caspase 家族、Bcl-2 家族等共同參與下構(gòu)成的一個復(fù)雜的凋亡信號網(wǎng)絡(luò)［12］，在心肌細(xì)胞凋亡中占據(jù)著重要地位。在各種促細(xì)胞凋亡信號作用下，心肌細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）過度開放，線粒體跨膜電位持續(xù)下降，外膜斷裂，ATP 合成減少，Cyto-C 等釋放入胞質(zhì)［7］。在ATP／dATP 存在下，Cyto-C 與凋亡蛋白活化因子（Apaf-1）形成“凋亡體”復(fù)合物，通過Apaf-1 氨基端的caspase募集結(jié)構(gòu)域募集多個Caspase-9 前體，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)，激活下游caspase-3，引起心肌細(xì)胞凋亡［8］。Bax 與Bcl-2 通過形成同源或異源二聚體參與心肌細(xì)胞凋亡，Bcl-2 能抑制許多因素引起的心肌細(xì)胞凋亡，而Bax 過量表達(dá)可抑制Bcl-2 作用，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡［9］。Bcl-2／Bax 比率作為調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的“可變電阻器”（rheo-stat），Bax 可促進(jìn)線粒體mPTP 開放，使線粒體外基質(zhì)內(nèi)流，滲透壓失衡，細(xì)胞器腫脹、變形，線粒體內(nèi)、外膜裂解，釋放Cyto-C，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡［13］。

動物實驗證實［14-15］，纈沙坦能夠通過抑制氧化應(yīng)激調(diào)控心力衰竭模型大鼠的心肌細(xì)胞凋亡，并顯著下調(diào)線粒體凋亡相關(guān)蛋白電壓依賴陰離子通道（VDAC）、第二個線粒體來源的胱氨酸酶激活劑（Smac）蛋白表達(dá)情況。本實驗提示，強(qiáng)心顆粒明顯改善慢性心力衰竭心氣虛兼大鼠的線粒體超微結(jié)構(gòu)，降低線粒體跨膜電位下降的心肌細(xì)胞比例，增加心肌組織ATP 合成能力，下調(diào)Cyto-C、Clcaspase-3、Cl-caspase-9 蛋白表達(dá)，提高Bcl-2／Bax比率，并與纈沙坦比較改善更為顯著，提示強(qiáng)心顆粒能夠通過調(diào)控線粒體凋亡通路改善慢性心力衰竭心氣虛兼血瘀水腫證大鼠的心功能及預(yù)后，但具體分子機(jī)制需要進(jìn)一步的實驗研究。