姜黃素對(duì)急性肺損傷小鼠炎癥反應(yīng)的改善作用

邵 奇，王倩梅，馬善波，張 偉，郭 超?

（1.銅川礦務(wù)局中心醫(yī)院藥劑科，陜西 銅川 727000；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院急診科，陜西 西安 710032；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710032）

急性肺損傷是由多種病因引起的，以急性進(jìn)行性呼吸窘迫、頑固性低氧血癥等為主要表現(xiàn)的臨床常見(jiàn)急危重癥，病死率可高達(dá)30%～40%［1-2］，尋找可靠有效的新型治療靶點(diǎn)仍然是目前亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。近年來(lái)眾多學(xué)者［3-5］研究發(fā)現(xiàn)，從姜黃中提取的多酚類活性成分姜黃素除可用于百草枯中毒、糖尿病、癌癥、帕金森等治療外，還可發(fā)揮良好的抗急性肺損傷作用，其作用機(jī)制與關(guān)鍵分子靶點(diǎn)可能與THF-β1／SMAD、Akt／Erk、MAPK／NF-κB 等多條信號(hào)通路相關(guān)［6］。本研究通過(guò)構(gòu)建小鼠急性肺損傷動(dòng)物模型，觀察TLR4／MyD88／NFκB 信號(hào)通路在姜黃素改善炎癥反應(yīng)中的作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康成年SPF 級(jí)BALB／c 雄性小鼠50 只，體質(zhì)量14～26 g，購(gòu)于空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（陜）2014-0013。實(shí)驗(yàn)前，在溫度（22±1）℃、相對(duì)濕度45%～75%、光照周期12／12 h 環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.2 試藥 姜黃素購(gòu)自四川成都德銳可生物科技有限公司（CAS＃458-37-7，含有量＞99.8%）。LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司（L2880）；TLR4 激動(dòng)劑（牙齦卟啉單胞菌內(nèi)毒素，LPS-PG）購(gòu)自上?？道噬锟萍加邢薰荆ㄘ浱?hào)tlrl-ppglps）；TLR4 抑制劑（瑞沙托維，TAK-242）購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司（貨號(hào)2A-13871-5）；TNF-α、IL-1β 和IL-6 試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子88（MyD88）和核因子-κB（NF-κB）ELISA 試劑盒均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。

1.3 儀器 包埋機(jī)購(gòu)自上海名元實(shí)業(yè)有限公司（型號(hào)JB-P5）；病理切片機(jī)購(gòu)自上海涵飛醫(yī)療器械有限公司（型號(hào)RM-2016）；電子顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司（型號(hào)BX50）。

2 方法

2.1 分組與造模 小鼠稱重麻醉后固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，備皮分離氣管和右側(cè)頸總動(dòng)脈，行氣管插管保持呼吸，頸總動(dòng)脈插管監(jiān)測(cè)血壓，并備用采血通道。急性肺損傷組以5 mg／kg 劑量腹腔注射脂多糖（LPS）建立模型［7］。50 只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、急性肺損傷組、姜黃素干預(yù)組、TLR4 激動(dòng)劑組、TLR4 抑制劑組，對(duì)照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水，姜黃素干預(yù)組在給予5 mg／kg LPS 前30 min 腹腔注射姜黃素200 mg／kg，TLR4 激動(dòng)劑組和TLR4抑制劑組分別以3 mg／kg LPS-PG 和TAK-242 在200 mg／kg 姜黃素給予前10 min 腹腔注射［8］。

2.2 肺組織病理形態(tài)觀察 快速打開小鼠胸腔，取出肺組織，冰上取左肺，用冰生理鹽水沖洗，取其下方1 ／3 肺組織用于HE 染色及肺組織病理學(xué)評(píng)分，每組選6 張，每張選4 個(gè)視野（×400），計(jì)數(shù)受損肺泡（肺泡腔RBC 或WBC＞2 個(gè)）占肺泡總數(shù)的百分比，即肺損傷組織學(xué)定量評(píng)價(jià)指標(biāo)（IQA）［1，9］，其余肺組織-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 ELISA 檢測(cè) 腹腔注射LPS 或生理鹽水24 h后，經(jīng)頸總動(dòng)脈插管取血，4 ℃、3 000 r／min 離心15 min 后，吸取上清，依據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明書，分別測(cè)定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平，以及肺組織TLR4、MyD88、NF-κB 水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料均以（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平 如表1 所示，與對(duì)照組比較，急性肺損傷組小鼠血清TNFα、IL-1β、IL-6 水平顯著升高（P＜0.01）；與急性肺損傷組比較，姜黃素干預(yù)組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平顯著降低（P＜0.01）；與姜黃素干預(yù)組比較，TLR4 激動(dòng)劑組小鼠血清三者水平顯著升高（P＜0.01），TLR4 抑制劑組小鼠血清三者水平顯著降低（P＜0.01）。

表1 各組血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（±s， n=10）Tab.1 Comparison of serum TNF-α，IL-1β and IL-6 levels among various groups（±s， n=10）

表1 各組血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（±s， n=10）Tab.1 Comparison of serum TNF-α，IL-1β and IL-6 levels among various groups（±s， n=10）

注：與對(duì)照組比較，??P＜0.01；與急性肺損傷組比較，＃＃P＜0.01；與姜黃素干預(yù)組比較，＆＆P＜0.01

3.2 肺組織TLR4、MyD88、NF-κB 水平 如表2所示，與對(duì)照組比較，急性肺損傷組小鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB 水平顯著升高（P＜0.01）；與急性肺損傷組比較，姜黃素干預(yù)組小鼠肺組織三者水平顯著降低（P＜0.01）；與姜黃素干預(yù)組相比，TLR4 激動(dòng)劑組小鼠肺組織三者水平顯著升高（P＜0.01），TLR4 抑制劑組小鼠肺組織三者水平顯著降低（P＜0.01）。

表2 各組肺組織TLR4、MyD88、NF-κB 水平比較（±s， n=10）Tab.2 Comparison of TLR4，MyD88 and NF-κB levels in lung tissues among various groups（±s， n=10）

表2 各組肺組織TLR4、MyD88、NF-κB 水平比較（±s， n=10）Tab.2 Comparison of TLR4，MyD88 and NF-κB levels in lung tissues among various groups（±s， n=10）

注：與對(duì)照組比較，??P＜0.01；與急性肺損傷組比較，＃＃P＜0.01；與姜黃素干預(yù)組比較，＆＆P＜0.01.

3.3 肺組織病理學(xué)變化及評(píng)分 光鏡下可見(jiàn)對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)比較完整，肺泡壁薄，肺泡腔輪廓清晰；急性肺損傷組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞、塌陷甚至消失，肺泡隔明顯增寬且肺泡隔內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；姜黃素干預(yù)組小鼠部分肺泡腔融合消失，部分肺泡腔可見(jiàn)出血、滲出及少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；TLR4 激動(dòng)劑組小鼠肺泡擴(kuò)張融合、炎性細(xì)胞滲出較嚴(yán)重；TLR4 抑制劑組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)相對(duì)比較完整，肺泡壁較薄，肺泡腔輪廓較清晰，炎性細(xì)胞滲出和炎癥浸潤(rùn)則較輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)（HE，×400）Fig.1 Pathological morphologies of mouse lung tissues in various groups（HE，×400）

與對(duì)照組比較，急性肺損傷組小鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分顯著升高（P＜0.01）；與急性肺損傷組比較，姜黃素干預(yù)組評(píng)分顯著降低（P＜0.01）；與姜黃素干預(yù)組比較，TLR4 激動(dòng)劑組評(píng)分顯著升高（P＜0.01），TLR4 抑制劑組評(píng)分明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

4 討論

急性肺損傷是現(xiàn)代危重病醫(yī)學(xué)的重大難題，主要表現(xiàn)為急性呼吸困難和頑固性低氧血癥［10］，其最突出的特點(diǎn)是因過(guò)度炎癥反應(yīng)引起彌漫性肺泡毛細(xì)血管膜損傷，導(dǎo)致肺水腫、肺不張、毛細(xì)血管通透性增加以及肺部氣體交換障礙。膿毒癥是臨床急性肺損傷最常見(jiàn)的病因之一，因此本研究采用常用的腹腔注射LPS 方法建立內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致急性肺損傷的小鼠模型，模擬臨床急性肺損傷的發(fā)生，并同時(shí)觀察TLR4／MyD88／NF-κB 信號(hào)通路在姜黃素改善急性肺損傷小鼠炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制。

表3 各組肺組織病理學(xué)評(píng)分比較（±s， n=6）Tab.3 Comparison of pathological scores in lung tissues among various groups（±s， n=6）

表3 各組肺組織病理學(xué)評(píng)分比較（±s， n=6）Tab.3 Comparison of pathological scores in lung tissues among various groups（±s， n=6）

注：與對(duì)照組比較，??P＜0.01；與急性肺損傷組比較，＃＃P＜0.01；與姜黃素干預(yù)組比較，＆＆P＜0.01.

TNF-α 是機(jī)體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，也是急性肺損傷炎癥反應(yīng)的一個(gè)較為客觀的指標(biāo)［11］，釋放后可迅速激活肺組織中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血小板等，進(jìn)而誘導(dǎo)其他炎性因子的產(chǎn)生和釋放，發(fā)揮“級(jí)聯(lián)放大”的作用，不斷加重肺組織損傷［12-13］。在整個(gè)炎癥反應(yīng)中，TNF-α 是始動(dòng)因素，IL-1β 起協(xié)同作用［14-15］，后者雖不能直接活化炎性白細(xì)胞，但可刺激其他炎性因子（如IL-6、IL-8 等）的分泌，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)展［16］。

Toll 樣受體家族是一類天然免疫受體，廣泛分布于機(jī)體淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，可通過(guò)識(shí)別病原微生物表面的配體-病原體相關(guān)分子模式（如G-菌的LPS），通過(guò)一系列信號(hào)通路介導(dǎo)炎癥介質(zhì)釋放，在天然免疫防御中發(fā)揮重要作用［17-18］。TLR4 是目前Toll 樣受體研究中最多的一種，也是靶細(xì)胞上LPS 引發(fā)炎癥反應(yīng)的主要配體，在內(nèi)毒素性急性肺損傷 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。LPS可激活TLR4 通路，然后通過(guò)髓樣分化蛋白88（MyD88）依賴性途徑介導(dǎo)多種炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與炎性反應(yīng)，以誘導(dǎo)下游的NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶的早期相活化為特征，主要介導(dǎo)炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）產(chǎn)生［19-20］。

本研究發(fā)現(xiàn)，LPS 致急性肺損傷小鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 水平顯著升高，肺組織病理?yè)p傷明顯增加、肺組織病理學(xué)評(píng)分升高；姜黃素干預(yù)可顯著降低急性肺損傷小鼠炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6 等）水平，減輕肺組織病理?yè)p傷，降低肺組織病理學(xué)評(píng)分。本研究還證實(shí)，急性肺損傷小鼠肺組織TLR4、MyD88、NF-κB 水平均明顯升高，而姜黃素可顯著降低三者水平，這與炎性細(xì)胞和炎癥因子的表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致，提示姜黃素可能通過(guò)抑制TLR4 受體的表達(dá)，序貫影響TLR4／MyD88／NF-κB 信號(hào)通路，抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 釋放，從而顯著改善LPS 導(dǎo)致的小鼠急性肺損傷。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)為急性肺損傷的預(yù)防提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，姜黃素有望成為相關(guān)新型藥物。然而，本研究觀察指標(biāo)有限，姜黃素在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性、利用率、毒副作用如何，以及能否在臨床展開試驗(yàn)尚不明確，有待將來(lái)進(jìn)一步研究。