兩種復(fù)合菌制作天然腌制灌腸效果研究

李沛然，朱迎春，楊華，梁麗雅，馬儷珍，*

（1.天津農(nóng)學(xué)院總務(wù)處，天津300384；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西晉中030801；3.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津300384；4.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384）

隨著人們對(duì)綠色食品的需求越來(lái)越高，綠色腌肉制品的開(kāi)發(fā)逐漸成為研究熱點(diǎn)，根據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)準(zhǔn)則規(guī)定，綠色和有機(jī)肉制品生產(chǎn)過(guò)程中不允許加入化學(xué)合成型試劑亞硝酸鹽[1-3]，但是亞硝酸鈉作為腌肉制品中必須使用的食品添加劑，對(duì)腌肉制品發(fā)色、抑制肉毒梭狀芽孢桿菌等方面有良好的作用，目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)可以完全替代亞硝酸鹽作用的物質(zhì)[4-5]。如何做到既能發(fā)揮亞硝酸鹽對(duì)腌肉制品的安全保障作用，又能滿足綠色有機(jī)腌肉制品的生產(chǎn)需要，成為困擾綠色腌肉制品生產(chǎn)的一大難題。近幾年有國(guó)外學(xué)者提出“天然腌制”的新思路，其原理是利用具有硝酸鹽還原作用并可應(yīng)用于肉制品加工中的微生物，將天然來(lái)源的硝酸鹽（比如蔬菜）轉(zhuǎn)化為天然型的亞硝酸鹽，從而替代傳統(tǒng)人工合成型亞硝酸鹽制作腌肉制品。Krause 利用具有硝酸鹽還原作用的肉葡萄球菌去發(fā)酵硝酸鹽含量很高的蔬菜，將發(fā)酵后的蔬菜粉制作灌腸并研究效果。目前，應(yīng)用在肉制品領(lǐng)域的商業(yè)開(kāi)發(fā)復(fù)合菌種較多，部分菌種具有硝酸鹽還原能力，但是在天然腌制領(lǐng)域利用較少，如何利用商業(yè)化復(fù)合菌種生產(chǎn)天然腌肉制品，對(duì)于工廠生產(chǎn)具有一定現(xiàn)實(shí)意義[6-7]。

本文以意大利SACCO 公司的WBL-45 復(fù)合菌種和VBL-97 復(fù)合菌種為研究對(duì)象，制作芹菜發(fā)酵液，通過(guò)改變復(fù)合菌種添加量和發(fā)酵時(shí)間，研究發(fā)酵芹菜汁中硝酸鹽、pH 值和亞硝酸鹽的變化規(guī)律，確定兩種復(fù)合菌生成天然亞硝酸鹽最佳發(fā)酵條件，再分別以這兩種復(fù)合菌制作的發(fā)酵芹菜粉加工灌腸，以成品的亞硝酸鹽殘留、脂肪氧化值和色澤為指標(biāo)，與合成型亞硝酸鹽制作灌腸對(duì)比，研究?jī)煞N發(fā)酵芹菜粉灌腸的品質(zhì)效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原材料

芹菜、豬背最長(zhǎng)肌和豬肥膘：天津侯臺(tái)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.1.2 試驗(yàn)菌

SACCO VBL-97 菌株和 SACCO WBL-45 菌株：意大利SACCO 公司；薩科VBL-97 菌株總菌數(shù)3.75×1010CFU/g 由木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus） 和清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）組成。薩科WBL-45 菌株總菌數(shù)4.25×1010CFU/g由肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）和清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）組成。

1.1.3 試劑與調(diào)料

乙酸鋅、硼砂、鹽酸奈乙二胺、亞鐵氰化鉀、對(duì)氨基苯磺酸等（均為分析純）：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；桂皮、淀粉、胡椒粉、食鹽、亞硝酸鹽、味精等（均為食品級(jí)）：天津中英保健食品股份有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

恒溫振蕩器（Bluepard THZ-98AB）：上海-恒科學(xué)儀器有限公司；高壓滅菌鍋（SX-300）：日本國(guó)東京TOMY 公司；電子天平（BS 224S）：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；pH 計(jì)（PB—10）：Sartorius 公司；榨汁機(jī)（All Basic S25）：IKA 公司；離心機(jī)（ST40R）：德國(guó)Theromo Scientific；紫外分光光度計(jì)（UV-1800）：日本島津公司；絞肉機(jī)（BJ-MM12）：廣東省韶關(guān)北江機(jī)電廠；色差儀（CM-5）：KONICA MINOLTA 公司；高速剪切分散乳化機(jī)（FA25）：德國(guó)弗魯克公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 發(fā)酵芹菜液

芹菜液制作：芹菜經(jīng)浸泡、清洗、去葉、切段、榨汁后制得。

芹菜發(fā)酵液的配制：①VBL-97 芹菜發(fā)酵液配制：準(zhǔn)備35 個(gè)500 mL 三角瓶，平均分為5 組，5 組三角瓶的菌種添加量依次為 5、10、50、200、500 mg，所有瓶中加入葡萄糖24 g，芹菜汁150 g，最后用無(wú)菌水補(bǔ)充至總重量為300 g，使VBL-97 菌株的接種量分別達(dá)到6.25×105、1.25×106、6.25×106、2.5×107、6.25×107CFU/g。將5 組芹菜發(fā)酵液于38 ℃恒溫振蕩器中發(fā)酵150 h（150 r/min），分別在第 0、12、24、60、96、120 h 和 150 h從每組中取出一個(gè)樣品，測(cè)定其亞硝酸鹽、硝酸鹽含量及pH 值。②WBL-45 芹菜發(fā)酵液配制：配制方法同①，使 WBL-45 菌株接種量分別達(dá)到 7.08×105、1.42×106、7.08×106、2.83×107、7.08×107CFU/g。最后按照亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化量最高時(shí)的菌種添加濃度和發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)，分別制作VBL-97 和WBL-45 芹菜發(fā)酵液，冷凍干燥后得到發(fā)酵芹菜粉備用。

1.3.2 灌腸的制作

將7.2 kg 豬背最長(zhǎng)肌用絞肉機(jī)絞碎，2.7 kg 豬肥膘手工切成0.2 cm～0.3 cm 見(jiàn)方肥丁，按對(duì)照組、試驗(yàn)組 1（VBL-97）、試驗(yàn)組 2（WBL-45）將瘦肉和肥肉丁平均分為3 份，首先進(jìn)行瘦肉腌制：對(duì)照組（CK）加入100 mg/kg 亞硝酸鈉和2%食鹽拌勻，試驗(yàn)組（VBL-97）加入1%VBL-97 凍干發(fā)酵芹菜粉和2%食鹽拌勻（以瘦肉重計(jì)），試驗(yàn)組（WBL-45）加入 1%WBL-45 凍干發(fā)酵芹菜粉和2%食鹽拌勻（以瘦肉重計(jì)）。3 組瘦肉攪拌混勻1 min 后，在4 ℃條件下腌制16 h。腌制結(jié)束后，各組均添加肥膘30%、味精2%、胡椒粉0.2%、豆蔻粉0.1%、水5%（以瘦肉重計(jì)），攪拌均勻后灌腸，經(jīng)結(jié)扎、漂洗、針刺排氣后，掛入煙熏爐50 ℃烘烤1 h，后在80 ℃～85 ℃水中煮制，確保中心溫度達(dá)到72 ℃后停止加熱，放入烤爐里50 ℃干燥1 h，冷卻后真空包裝，分別在冷藏的第0 天、第1 天、第3 天、第5 天和第7天測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定方法

1.4.1 亞硝酸鹽含量的測(cè)定

參考GB 5009.33-2010 《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中分光光度法[8]。

1.4.2 硝酸鹽含量的測(cè)定

參考NY/T 1279-2007《蔬菜、水果中硝酸鹽的測(cè)定》測(cè)量方法[9]。

1.4.3 pH 值的測(cè)定

從發(fā)酵液中取3 mL～5 mL，攪勻，將pH 計(jì)探頭置于發(fā)酵液中部，讀取pH 值數(shù)值。

1.4.4 硫代巴比妥酸值（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[10]中方法。

1.4.5 色澤測(cè)定

用色差儀測(cè)定樣品的a*值。

1.4.6 數(shù)據(jù)分析

使用Statistix8.1 軟件進(jìn)行顯著性分析，使用Tukey HSD 比較方法，α 為 0.05 或 0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 WBL-45芹菜發(fā)酵液和VBL-97芹菜發(fā)酵液中pH值、硝酸鹽含量、亞硝酸鹽含量的測(cè)定

WBL-45 芹菜發(fā)酵液和VBL-97 芹菜發(fā)酵液中pH 值、硝酸鹽含量、亞硝酸鹽含量的測(cè)定見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 WBL-45 發(fā)酵芹菜液和VBL-97 芹菜發(fā)酵液中pH 值的測(cè)定Fig.1 The pH value determination of celery juice treated by WBL-45 and VBL-97

圖2 WBL-45 發(fā)酵芹菜液和VBL-97 芹菜發(fā)酵液中硝酸鹽含量的測(cè)定Fig.2 The nitrate determination of celery juice treated by WBL-45 and VBL-97

從圖1、圖2 和圖3 可以看出，一方面酸性代謝產(chǎn)物積累，pH 值持續(xù)下降，另一方面發(fā)酵菌株的抑制作用增強(qiáng)，硝酸鹽還原作用持續(xù)降低，發(fā)酵至24 h 左右時(shí)，pH 值和硝酸鹽降低至最低點(diǎn)，同時(shí)亞硝酸鹽生成量到最高點(diǎn)，且當(dāng)WBL-45 接種量為1.42×106CFU/g，亞硝酸鹽的生成量最高，達(dá)到1 013 mg/kg，VBL-97接種量為1.25×106CFU/g 時(shí)，亞硝酸鹽峰值含量最大，達(dá)到256 mg/kg，因此WBL-45 初步選用接種量為1.42×106CFU/g、發(fā)酵時(shí)間為 24 h、發(fā)酵溫度為 38 ℃來(lái)制作發(fā)酵芹菜液，VBL-97 初步選用接種量為1.25×106CFU/g、發(fā)酵時(shí)間為24 h、發(fā)酵溫度為38 ℃來(lái)制作發(fā)酵芹菜液，并將此兩種發(fā)酵芹菜液凍干成粉應(yīng)用于后期灌腸制作。

2.2 灌腸貯藏期間亞硝酸鹽殘留量測(cè)定

灌腸貯藏期間亞硝酸鹽殘留量的變化如圖4 所示。

由于本試驗(yàn)灌腸為盡可能滿足綠色食品要求，配料中未加入人工合成型抗壞血酸鹽，抗壞血酸鹽作為發(fā)色助劑，廣泛應(yīng)用于腌肉制品生產(chǎn)，可起到降低亞硝酸鹽殘留的作用，因此對(duì)照組灌腸在貯藏0 d 時(shí)的亞硝酸鹽殘留量高達(dá)60 mg/kg～80 mg/kg，但是通過(guò)橫向?qū)Ρ龋瑑蓚€(gè)試驗(yàn)組灌腸中的亞硝酸鹽殘留量明顯低于亞硝酸鈉組的灌腸（P＜0.05），說(shuō)明在亞硝酸鹽殘留量方面，添加發(fā)酵芹菜粉的灌腸比添加相同質(zhì)量亞硝酸鈉的灌腸更安全。通過(guò)此試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明發(fā)色助劑在控制亞硝酸鹽殘留方面的重要性，尋找符合綠色腌肉制品要求的發(fā)色助劑也將成為一個(gè)研究方向。

圖3 WBL-45 發(fā)酵芹菜液和VBL-97 芹菜發(fā)酵液中亞硝酸鹽的變化規(guī)律Fig.3 The nitrite determination of celery juice treated by WBL-45 and VBL-97

圖4 灌腸貯藏期間亞硝酸鹽殘留量測(cè)定Fig.4 The residual nitrite determination of sausages under refrigeration

2.3 灌腸貯藏期間TBSRS值測(cè)定

灌腸貯藏期間TBARS 值變化如圖5 所示。

圖5 灌腸貯藏期間TBARS 值測(cè)定Fig.5 The TBARS determination of sausages under refrigeration

TBARS 值代表肉制品被氧化的程度，3 組灌腸TBARS 值在均呈現(xiàn)顯著的上升趨勢(shì)（P＜0.05），控制脂肪氧化效果最好的是 WBL-45 組（P＜0.05），其次依次為 VBL-97 組和亞硝酸鈉組，VBL-97 組在 0～5 d 內(nèi)與亞硝酸鈉組不存在明顯差異（P＞0.05），第7 天控制脂肪氧化效果開(kāi)始好于亞硝酸鈉組（P＜0.05），說(shuō)明WBL-45 發(fā)酵芹菜粉和VBL-97 發(fā)酵芹菜粉制作的灌腸制品抗氧化性整體好于亞硝酸鈉組。

2.4 灌腸貯藏期間a*值測(cè)定

灌腸貯藏期間a*值變化如圖6 所示。

圖6 灌腸貯藏期間a*值測(cè)定Fig.6 The a*determination of sausages under refrigeration

3 組灌腸 a*值呈顯著的下降趨勢(shì)（P＜0.05），且在1 d 和5 d 時(shí)，3 組灌腸的a*值不存在明顯差異（P＞0.05），在 3 d 和 7 d 時(shí)，WBL-45 組的 a*值大于 VBL-97 組（P＜0.05），可以看出，發(fā)酵芹菜粉與亞硝酸鈉的發(fā)色作用接近，且WBL-45 發(fā)酵芹菜粉對(duì)于灌腸的發(fā)色作用要略好于VBL-97 發(fā)酵芹菜粉。

3 結(jié)論

復(fù)合菌種WBL-45 和VBL-97 在發(fā)酵天然芹菜汁過(guò)程中，均具備一定硝酸鹽還原作用，并且亞硝酸鹽產(chǎn)生峰值均在芹菜液pH 以及硝酸鹽含量達(dá)到最低時(shí)出現(xiàn)。復(fù)合菌種WBL-45 較VBL-97 硝酸鹽還原能力更強(qiáng)，在38 ℃發(fā)酵條件下，WBL-45 接種量為1.42×106CFU/g、發(fā)酵時(shí)間24 h 時(shí)，亞硝酸鹽峰值量可達(dá)1 013 mg/kg，VBL-97 在最佳接種量為 1.25×106CFU/g、發(fā)酵進(jìn)24 h 時(shí)，亞硝酸鹽峰值量為256 mg/kg。利用兩種發(fā)酵芹菜粉制作的灌腸，a*與添加亞硝酸鈉組存在差異但相差不大，且在TBARS 值和亞硝酸鹽殘留方面優(yōu)于亞硝酸鈉組，同時(shí)WBL-45 發(fā)酵芹菜粉灌腸的a*值要比VBL-97 組高，TBARS 值要低于后者，為今后替代人工合成亞硝酸鹽生產(chǎn)綠色腌肉制品提供了新思路。