pH漸變條件下雙酶分步酶解的豬皮膠原肽的體內(nèi)外抗氧化活性研究

張康華，姜珊，高鵬，代龍

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250355）

豬皮中膠原蛋白含量達(dá)到29%[1]，通過(guò)酶解豬皮膠原蛋白可得到具有多種生理活性的肽，其中抗氧化活性肽由于安全、高效等特點(diǎn)，被用于食品及化妝品中[2-3]。因此進(jìn)行豬皮膠原肽抗氧化性的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。從豬皮中提取膠原蛋白的方法包括堿提取、酸提取、酶解提取、熱水提取[4-6]，其中仿生酶解應(yīng)用較廣，提取效果較優(yōu)，但工藝復(fù)雜，因加入了酸堿調(diào)節(jié)pH 值，后期需要除鹽易造成肽損失，且成本較高，因此本研究采用堿性蛋白酶及菠蘿蛋白酶在沒(méi)有外加酸堿調(diào)節(jié)pH 的條件下對(duì)豬皮進(jìn)行酶解，根據(jù)參考文獻(xiàn)[7-14]及本實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化的酶解條件進(jìn)行提取，然后對(duì)其進(jìn)行超濾分離純化，得到不同分子量的膠原肽酶解液，再將上述各組分進(jìn)行體內(nèi)外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，考察其抗氧化能力。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

新鮮豬皮：購(gòu)于龍大肉食店；堿性蛋白酶（2 000 U/mg）、菠蘿蛋白酶（2 000 U/mg）：上海佛森生物科技有限公司；牛血清白蛋白（LOT：Y13S9S70264）：上海源葉生物科技有限公司；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH，LOT：C10430696）、2，2’-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸） 二銨鹽（ABTS，LOT：C10144809）：上海麥克林生化科技有限公司；谷胱甘肽（LOT：D1711070）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；小白鼠雌雄各半：山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；微量丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPX）試劑盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒：上海信帆生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與型號(hào)

卷式超濾膜（1 kDa、3 kDa）：北京市旭邦膜設(shè)備有限責(zé)任公司；FA2204B 萬(wàn)分之一電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；BT300-2J 蠕動(dòng)泵：保定蘭格恒流泵有限公司；真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HH-S4 數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)宇儀器制造有限公司；UV-1800 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：島津儀器有限公司；電滲析器：滄州市眾邦水處理技術(shù)有限公司；高速離心機(jī)：上海精密儀器有限公司。

2 方法

2.1 各分子量豬皮膠原肽的制備

取鮮豬皮，刮去皮下雜質(zhì)，以剪刀剪成厚度小于2 mm、長(zhǎng)度小于2 cm 的碎塊，用5 倍量0.3%氫氧化鈉溶液浸泡8 h，濾去堿液，水洗至近中性，勻漿5 min，加8 倍量水加熱煮沸15 min，待冷至約55 ℃，加入1 %堿性蛋白酶，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，55 ℃保溫酶解1 h（60 r/min），再加入1 %菠蘿蛋白酶，55 ℃保溫酶解3 h（60 r/min），酶解液加熱煮沸15 min，過(guò)濾，濾液放冰箱中冷藏12 h，離心，取上清液減壓濃縮（60 ℃～65 ℃，-0.07 MPa～-0.08 MPa）至相對(duì)密度為 1.10～1.15（60 ℃），冷凍干燥（-47 ℃，15 Pa）后即得豬皮酶解原液凍干粉。取適量?jī)龈煞廴苡谒?，先后用不同分子截留量?、1 kDa）的超濾膜進(jìn)行分離，分別得到M＞3 kDa 組分、1 kDa＜M＜3 kDa 組分、M ＜1 kDa 組分。

2.2 各組分膠原蛋白肽含量指標(biāo)測(cè)定

采用福林酚比色法[15]，以牛血清白蛋白溶液（0.22 mg/mL）為對(duì)照品，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算線(xiàn)性回歸方程，并從回歸方程中計(jì)算總肽的含量。

2.3 不同分子量肽體外抗氧化能力的測(cè)定

2.3.1 對(duì)DPPH 自由基清除能力的測(cè)定

精確稱(chēng)量4.10 mg DPPH，溶解到100 mL 無(wú)水乙醇中，配制成濃度為6.5×10-5mol/L DPPH 乙醇溶液。分別吸取1 mL 樣液與1 mL DPPH 的無(wú)水乙醇溶液置于試管中，搖勻，在室溫反應(yīng)30 min 后在波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光度（A）i；分別吸取1 mL 樣液和無(wú)水乙醇于試管中，搖勻，室溫反應(yīng)30 min 后在517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A2）；最后分別吸取1 mL DPPH 無(wú)水乙醇溶液與無(wú)水乙醇于試管中，搖勻，在室溫反應(yīng)30 min 后在517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A0）[16]。按公式（1）計(jì)算清除率。

2.3.2 對(duì)ABTS+自由基清除能力的測(cè)定

取7 mmol/mL 的ABTS 溶液15 mL，室溫下與等體積的4.9 mmol/mL 過(guò)硫酸鉀溶液混合后暗處放置12 h，制成 ABTS+儲(chǔ)備液，再用 pH 7.4 的 PBS 稀釋 20 倍制成ABTS+工作液。取不同濃度的樣品溶液和谷胱甘肽溶液1 mL，加入2.0 mL 的ABTS+工作液，震搖均勻后常溫暗處放置10 min，在734 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度[17]。按公式（2）計(jì)算清除率。

式中：A1為樣品組吸光度，A2為樣品本底吸光度（以等體積蒸餾水代替ABTS+溶液），A0為空白對(duì)照組吸光度（以等體積蒸餾水代替樣品溶液）。

2.3.3 不同分子量豬皮膠原肽組分對(duì)O2-·活性清除能力測(cè)定

鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定參照李婷等[18]的測(cè)定方法。不同分子量豬皮膠原肽抑制鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定則按上述步驟，加入pH=8.2 緩沖液4.7 mL，然后分別加入不同分子量的豬皮膠原肽溶液，以蒸餾水補(bǔ)至4.2 mL，加入0.3 mL 鄰苯三酚迅速搖勻，同樣以10 mmol/L 鹽酸溶液作為空白管，同上測(cè)定。按公式（3）計(jì)算加入豬皮膠原肽后鄰苯三酚的自氧化速率，按公式（4）計(jì)算清除率。

式中：A3為 30 s 時(shí)的吸光度；A4為 4 min 時(shí)的吸光度；△A0為鄰苯三酚自氧化速率，△A 為加入豬皮膠原肽溶液后鄰苯三酚的自氧化速率。

2.3.4 不同分子量豬皮膠原肽組分對(duì)·OH 的清除能力測(cè)定

精密量取150 mmol/L pH=7.4 磷酸鹽緩沖液2.0 mL、7.5 mmo1/L 鄰二氮菲 0.2 mL、7.5 mmol/L 硫酸亞鐵溶液0.2 mL、不同豬皮膠原肽組分試樣0.4 mL、蒸餾水0.8 mL、體積分?jǐn)?shù)0.1%過(guò)氧化氫0.4 mL 于試管中，混勻做試樣組，將各試管同時(shí)于37 ℃恒溫放置1 h，在536 nm 處測(cè)定吸光度?？瞻捉M以蒸餾水代替樣品，其余步驟同試樣組；空白對(duì)照組以蒸餾水分別代替試樣和雙氧水，其余步驟同試樣組[19-20]。按公式（5）計(jì)算·OH清除率。

式中：A試樣為試樣組的吸光度值，A0為空白組的吸光度值，A空白對(duì)照為空白對(duì)照組的吸光度值。

2.4 不同分子量膠原蛋白肽體內(nèi)抗氧化活性的測(cè)定

2.4.1 小鼠分組飼養(yǎng)和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練

按照體重進(jìn)行隨機(jī)分組，共分成4 個(gè)組，一個(gè)對(duì)照組和3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組。且每組多養(yǎng)2 只～3 只預(yù)防灌胃或者運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)溺水發(fā)生意外。日常自由采食飲水，灌胃飼養(yǎng)35 d，灌胃時(shí)間安排在運(yùn)動(dòng)前2 h，對(duì)照組灌胃雙重蒸餾水，實(shí)驗(yàn)組分別給予3 個(gè)不同分子量段的酶解肽液，飼養(yǎng)量為動(dòng)物體重的3%。每天游泳訓(xùn)練一次，每次 20 min，水溫（30±2）℃，不負(fù)重。

2.4.2 血清的制備

運(yùn)動(dòng)后休息30 min，用暖風(fēng)機(jī)烘干小鼠，取血試管預(yù)先加入肝素抗凝劑（12 500 單位稀釋30 倍），并低溫烘干。頸動(dòng)脈無(wú)麻醉狀態(tài)下取血，搖勻，即刻再放回冰浴中冷卻，3 000 r/min 離心10 min，分離血清，然后將血清傾入另一潔凈試管低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.3 指標(biāo)測(cè)定

按照試劑盒指定的方法測(cè)定微量丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、總超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，T-SOD）活力、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）活力、總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC） 和過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）活力。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同分子量膠原蛋白肽的含量測(cè)定結(jié)果

福林酚比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1，不同分子量豬皮膠原蛋白肽含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 福林酚比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve of fosinophenol colorimetric method

3.2 不同分子量膠原蛋白肽的抗氧化能力測(cè)定結(jié)果

3.2.1 不同分子量膠原蛋白肽對(duì)DPPH 自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

不同分子量膠原蛋白肽對(duì)DPPH 自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

表1 不同分子量豬皮膠原蛋白肽含量測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination of collagen peptide content in pig skin with different molecular weight

圖2 DPPH 自由基清除結(jié)果Fig.2 DPPH radical scavenging results

根據(jù)圖2 可以看出，在0～6 mg/mL 的肽濃度內(nèi)，不同分子量豬皮膠原肽對(duì)DPPH 自由基都有一定的清除作用，且隨著豬皮肽濃度的增加，各組分對(duì)DPPH 自由基的清除率也隨之升高。其中，M＜1 kDa 組分和1 kDa＜M＜3 kDa 組分對(duì)DPPH 自由基的清除能力相近，清除率最高分別可達(dá)到87.73%、84.11%；酶解原液最大清除率為73.15%，而M＞3 kDa 組分的清除能力比酶解原液要弱，最大清除率為68.58%。

3.2.2 不同分子量膠原蛋白肽對(duì)ABTS+自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

不同分子量膠原蛋白肽對(duì)ABTS+自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 ABTS+自由基清除結(jié)果Fig.3 Results of ABTS+radical scavenging

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在0～1 mg/mL 的肽濃度范圍內(nèi)，3 個(gè)不同分子量肽段對(duì)ABTS+自由基清除能力大體一致。在肽濃度小于0.5 mg/mL 時(shí)，M＜1 kDa 組分和1 kDa＜M＜3 kDa 組分的抗氧化能力相近，并略強(qiáng)于 M＞3 kDa 組分；而在 0.5 mg/mL～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)，M＞3 kDa 組分的抗氧化能力最強(qiáng)，清除率最高可達(dá)到91.22%。

3.2.3 不同分子量豬皮膠原肽組分對(duì)O2-自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

不同分子量豬皮膠原肽組分對(duì)O2-自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 O2-自由基清除結(jié)果Fig.4 Results of O2-free radical scavenging

通過(guò)比較各組分對(duì)O2-自由基的清除率，M＜1 kDa組分與1 kDa＜M＜3 kDa 組分的清除能力最強(qiáng)，酶解原液次之，3 kDa 組分最弱。并且隨著肽濃度的增加，各組分對(duì)O2-自由基的清除率也升高，并逐漸趨于穩(wěn)定。

3.2.4 不同分子量豬皮膠原肽組分對(duì)OH 自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

不同分子量豬皮膠原肽組分對(duì)OH 自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 OH 自由基清除結(jié)果Fig.5 OH radical scavenging results

試驗(yàn)結(jié)果顯示，各組分對(duì)OH 自由基清除能力的順序?yàn)椋盒∮?1 kDa 組分＞1 kDa～3 kDa 組分＞大于 3 kDa組分，并且說(shuō)明不同分子量豬皮膠原肽對(duì)OH 自由基清除存在量效關(guān)系。在肽濃度為5.4 mg/mL 時(shí)，各組分的清除率達(dá)到最高，分別為79.13%、63.24%、42.85%。

3.3 各組分豬皮膠原肽體內(nèi)抗氧化活性的測(cè)定結(jié)果

各組分豬皮膠原肽體內(nèi)抗氧化活性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 各組分豬皮膠原肽的體內(nèi)抗氧化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Fig.6 Determination of antioxidant indexes of pig skin collagen peptides in vivo

從圖6 可以看出，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中的SOD、CAT、GSH-PX、T-AOC 與正常對(duì)照組比較均增大。MDA 是一種脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，可以直接反映機(jī)體的過(guò)氧化水平，各實(shí)驗(yàn)組的MDA 生成量均比對(duì)照組有明顯下降。經(jīng)方差分析，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性（P＜0.05），此外，M＜1 kDa 組與 1 kDa＜M＜3 kDa 組無(wú)顯著性差異，而M＞3 kDa 組與另外兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組均存在顯著性差異。表明該法酶解得到的不同分子量的豬皮蛋白肽有著良好的體內(nèi)活性，說(shuō)明利用酶解液灌胃小鼠具有提高生物抗氧化能力的功效，從而對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用在pH 漸變條件下使用堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶分步酶解，再超濾分離純化，通過(guò)研究不同分子量肽段的體內(nèi)外抗氧化能力，表明此方法酶解得到的各組分豬皮膠原肽均有一定的抗氧化活性，經(jīng)過(guò)綜合比較，M＜1 kDa 組分的抗氧化活性最強(qiáng)，1 kDa＜M＜3 kDa 組次之，M＞3 kDa 組最弱，說(shuō)明分子量大小會(huì)影響肽的抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)在保證抗氧化活性的前提下達(dá)到了節(jié)約成本、降低肽損失的目的，證明此方法可行，以期為豬皮膠原肽的酶解方法提供新的參考。