洪春桃,沈登鋒,魏斌,章建紅
(寧波市農業(yè)科學研究院 林業(yè)研究所,浙江 寧波 315040)
三葉青(Tetrastigmahemsleyanum),中文學名為三葉崖爬藤,又名蛇附子、石抱子、金線吊葫蘆、三葉對、小扁藤、三葉扁藤、攔山虎、雷膽子等,藥名為三葉青,是葡萄科崖爬藤屬多年生蔓生藤本植物,為中國特有珍稀中藥植物[1-2]。臨床上已逐步用于肝癌、肺癌、白血病與艾滋病等疾病的治療,被稱為安全無毒的“植物青霉素”[3]。由于人為過度采挖,三葉青野生資源銳減,已處于瀕危狀態(tài)[1, 4],因此,開展三葉青的組織快繁技術研究十分重要。許多研究人員進行了一定的初步研究,但是目前已報道的三葉青組織快繁體系中外植體選擇、滅菌方式、培養(yǎng)基配方和預期效果等都各不相同,給種植戶和研究人員在選擇三葉青組織培養(yǎng)方法時帶來較多不便。筆者通過文獻檢索篩選得到11種不同的三葉青的組織培養(yǎng)快繁技術體系,從外植體選擇、滅菌、腋芽誘導、愈傷組織誘導、叢生芽增殖和不定根誘導等方面對這11種體系進行評價和優(yōu)化,以期建立一種最佳的三葉青組織快繁的技術體系,為今后三葉青組織培養(yǎng)的快速繁殖體系提供科學依據(jù)。
實驗材料為寧波市農業(yè)科學研究院在鄞州區(qū)橫溪鎮(zhèn)大岙村栽培的三葉青種苗,2017年5月采集嫩葉和腋芽莖段帶回實驗室組培室進行組織培養(yǎng)試驗。組培室培養(yǎng)溫度為(25±2)℃,光周期為12 h∶12 h(光/暗),光照強度為4 000 lx。
1.2.1 外植體滅菌
綜合歸納不同文獻的試驗方法,篩選出3種外植體滅菌方式進行三葉青外植體的滅菌試驗,每組處理具體方法如下:處理1,選擇剪成塊狀的葉片與1~2 cm帶腋芽莖段作為外植體,流水沖洗3~4 h,75%乙醇浸泡1 min,含2~3滴吐溫20的0.1% HgCl215 min(40~50 r·min-1搖床振蕩消毒),MS培養(yǎng)基中加入1 mg·L-1氨芐、0.3 g·L-1真菌抑菌劑[5];處理2,選擇剪成塊狀的葉片與1~2 cm帶腋芽莖段作為外植體,流水沖洗30~60 min,70%乙醇浸泡1 min,含2~3滴吐溫20的0.1% HgCl2浸泡15 min,期間輕搖晃,無菌水清洗5次,無菌濾紙吸干水分,切去處理后莖段的兩端[6];處理3,選擇剪成塊狀的葉片與1~2 cm帶腋芽莖段作為外植體,再用5%洗衣粉水溶液漂洗5 min,再用自來水沖洗30 min,75%乙醇擦洗表面,0.1% HgCl2消毒5 min,2%次氯酸鈉消毒20 min,無菌水沖洗4~6次,再將莖段切成0.5~1.0 cm的小段,葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的塊狀[7]。每個處理葉片設5個重復,每個重復20片,共100片。每個處理莖段設3個重復,每個重復10個,共30個帶腋芽莖段,接種7 d后統(tǒng)計污染情況。
1.2.2 腋芽誘導
篩選5種文獻報道的腋芽誘導培養(yǎng)基,采用滅菌腋芽莖段進行腋芽誘導試驗,具體培養(yǎng)基配方如下:S1,WPM+0.8 mg·L-16-BA[5];S2,1/2MS+0.5 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA[6];S3,1/2MS+0.5 mg·L-16-BA[8];S4,MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA[7];S5,1/2MS+0.8 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1氨芐+0.3 mg·L-1真菌抑菌劑+25%活性炭(筆者自配培養(yǎng)基)。每個處理設3個重復,每個重復接種5個帶腋芽莖段,接種28 d后觀察并統(tǒng)計腋芽生長情況。
1.2.3 不定芽增殖
篩選4種文獻報道的不定芽增殖誘導的培養(yǎng)基,并對其進行不同組別試驗,具體培養(yǎng)基配方如下:C1,MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA[9];C2,MS+3.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA+2 g·L-1蛋白胨[10];C3,2/3MS+2.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA[11];C4,MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA[12]。以誘導得到的腋芽作為材料,接種到不定芽增殖培養(yǎng)基上,每個處理設3個重復,每個重復至少接種3個,接種70 d后觀察不定芽的愈傷生長與增殖情況。
1.2.4 不定根誘導試驗
將獲得的不定芽在節(jié)間處切下,進行不定根誘導實驗。篩選6種文獻報道的不定根誘導的培養(yǎng)基,具體配方如下:R1,WPM+1.0 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1IBA[5];R2,1/2MS+0.5 mg·L-1IBA[6];R3,MS+1.0 mg·L-1NAA[13];R4,1/2MS+1.0 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IBA[7];R5,MS+0.5 mg·L-1IBA[14];R6,1/2MS+1.0 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA[11]。每個處理設3個重復,每個重復接種5個腋芽,接種14 d后觀察并統(tǒng)計不定根生長情況。
所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析均使用SPSS 18.0軟件完成。
用3種不同外植體滅菌方式對三葉青含腋芽莖段與葉片進行處理,7 d后統(tǒng)計污染情況。由表1可知,處理2中2種外植體滅菌后效果較佳,未污染率達到97%;其次是處理1,葉片未污染率為92%,腋芽莖段為83%;處理3的滅菌效果較差,對2種外植體的滅菌效果均未達到50%。由此可見,以含腋芽莖段與葉片為外植體時,在0.1% HgCl2中添加適量表面活性劑吐溫20有助于增強滅菌效果。該方法也廣泛應用于其他藥用植物外植體的滅菌,如廣豆根[15]、金線蓮[16]等。
表1 滅菌方式對三葉青外植體的影響
用5種不同培養(yǎng)基配方進行腋芽的誘導培養(yǎng),結果顯示,S3培養(yǎng)基腋芽成活率最高,為96.7%;其次為S4、S1和S2培養(yǎng)基,其腋芽成活率分別為86.7%、83.3%和76.7%,S5培養(yǎng)基成活率最低(表2)。培養(yǎng)16 d后,S1~S4培養(yǎng)基出現(xiàn)不同程度的褐化,在S4培養(yǎng)基培養(yǎng)28 d后腋芽基部有愈傷組織生成(圖1)。S5培養(yǎng)基腋芽的成活率低,可能與添加的氨芐霉素和真菌抑制劑有關。此外,S5培養(yǎng)基可以抑制后期腋芽的褐化,說明加入活性炭對防褐化具有明顯的效果。綜上,采用S1,S2和S4培養(yǎng)基獲得的腋芽成活率基本與參考的文獻結果一致,但這些文獻沒有涉及褐化問題[5, 6, 17]。錢麗華[8]的研究沒有明確測定S3培養(yǎng)基中三葉青腋芽的成活率,本研究發(fā)現(xiàn)其成活率顯著都高于其他培養(yǎng)基,因此,建議采用1/2MS+0.5 mg·L-16-BA+25%活性炭進行腋芽的誘導。
表2 5種培養(yǎng)基配方培養(yǎng)16 d后三葉青腋芽的誘導情況
圖1 S3培養(yǎng)基和S4培養(yǎng)基上的腋芽
用4種不同培養(yǎng)基進行不定芽誘導增殖培養(yǎng),結果發(fā)現(xiàn),C1培養(yǎng)基的愈傷組織生長形態(tài)較好,多表現(xiàn)為深綠色,結構比較致密,其腋芽的出愈率為100%,易分化產生不定芽,且不定芽的增殖倍數(shù)為3.1(表3,圖2)。其次為C4培養(yǎng)基,腋芽的出愈率為93.3%,愈傷組織形態(tài)為淺綠色,結構致密,但不定芽誘導效果較C1培養(yǎng)基差。C2和C3培養(yǎng)基誘導的愈傷組織及其分化能力均較差,結構較為疏松,不定芽長勢弱(表3)。表明高濃度的6-BA和低濃度的NAA有助于三葉青愈傷組織的誘導,該結果與大多數(shù)報道一致[8, 9,17]。因此,建議采用MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA作為三葉青不定芽誘導增殖的較佳培養(yǎng)基。
表3 4種培養(yǎng)基培養(yǎng)70 d后不定芽的增殖情況
圖2 4種培養(yǎng)基培養(yǎng)70 d后不定芽的誘導增殖情況
用6種不同培養(yǎng)基配方進行三葉青不定根的誘導培養(yǎng),結果如表4和圖3所示。R2培養(yǎng)基誘導的不定根最多,平均為8.6個,平均根長為6.6 cm,有新葉長出,且長勢茂盛,為最佳誘導培養(yǎng)基(圖3中B)。R1、R3、R4均含有1.0 mg·L-1的NAA,誘導出的不定根有大量的根毛,R1培養(yǎng)基盡管有新葉長出,但長勢一般,R3和R4培養(yǎng)基誘導的根數(shù)較少,生長也較為緩慢,且根部有愈傷組織長出,不適合做不定根的誘導。 R6培養(yǎng)基包含1.0 mg·L-1NAA和1.0 mg·L-16-BA,嚴重限制了不定根的誘導和腋芽的生長,不建議使用該培養(yǎng)基誘導不定根(圖3中F)。以上培養(yǎng)基與前人研究結果有一定的差異,我們推測可能跟培養(yǎng)條件和藥品純度有關。R5培養(yǎng)基誘導的平均根個數(shù)為5.1個,根長達到7.8 cm,也有新葉長出,長勢也比較茂盛(圖3中E),其與R2培養(yǎng)基的區(qū)別在于采用MS為主培養(yǎng)基,而R2培養(yǎng)基采用1/2MS為主培養(yǎng)基,考慮到成本問題,建議采用R2培養(yǎng)基用于不定根的誘導。因此,最佳的三葉青不定根誘導培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg·L-1IBA。
表4 三葉青不定根的誘導結果
圖3 誘導不定根的形成
該研究的試驗結果大部分與文獻報道一致,但是也有部分數(shù)據(jù)無法重復文獻中的結果,這可能跟外植體選擇、實驗培養(yǎng)條件、操作人員的操作技巧,以及藥品純度都有直接的關系。經過比較試驗,優(yōu)化出一套三葉青高效組織快繁的技術體系:采用腋芽莖段為外植體,用75%乙醇消毒1 min,含3滴吐溫20的0.1% HgCl2滅菌15 min,接種于1/2MS+0.5 mg·L-16-BA+25%活性炭培養(yǎng)基誘導腋芽,21 d后接種于MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上進行不定芽增殖誘導,最后采用1/2MS+0.5 mg·L-1IBA培養(yǎng)基誘導,14 d后形成不定根。該研究可為研究人員進行三葉青組織快繁試驗提供一定的科學依據(jù),有助于縮短試驗周期,節(jié)約成本。