亞精胺對鎘脅迫下杞柳生長和生理特性的影響

尹澤潤，諸葛玉平*，婁燕宏*，潘 紅，崔秀敏，王 會，馮文杰，樊 平，李亞平

（1.土肥資源高效利用國家工程實驗室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東省現(xiàn)代創(chuàng)新發(fā)展促進(jìn)中心，濟(jì)南 250000；3.濱州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 濱州 256600）

我國鎘污染農(nóng)田面積已超過2×105hm2，全國超過三分之一的省區(qū)存在土壤鎘污染現(xiàn)象[1-2]。據(jù)報道，已有多地生產(chǎn)的稻米不符合農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)，成為了“鎘米”[3-4]。人體長期過量攝入鎘，會嚴(yán)重影響腎和肝的生理功能，影響鈣、鎂的吸收代謝，導(dǎo)致一系列疾病[5]。近年來，鎘污染事件頻發(fā)，鎘污染土壤修復(fù)已經(jīng)迫在眉睫[6]。植物修復(fù)因其具有綠色、高效、低廉等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用，利用植物對重金屬的吸附、轉(zhuǎn)移、清除等作用實現(xiàn)污染土壤的生態(tài)修復(fù)。已有研究證明，柳屬植物多對鎘具有較強(qiáng)的耐受性，其中部分品種對鎘的富集能力較強(qiáng)[7-8]。杞柳（Salix integra）是柳屬（Salix）灌木，它的枝莖生長能力很強(qiáng)，枝條產(chǎn)量高，尤其是細(xì)長而堅韌的柳條，去除掉表皮之后，是一種優(yōu)良的編織材料，也是我國栽培最廣泛的灌木柳，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。因此，探討杞柳修復(fù)鎘污染土壤的潛力，對于豐富用于植物修復(fù)的植物種類具有重要的意義。但是，在鎘脅迫下，杞柳生長勢必受到鎘的抑制作用而影響其修復(fù)效果，所以杞柳鎘耐受性的強(qiáng)化研究仍有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

亞精胺是廣泛存在于動植物體內(nèi)的一種內(nèi)源激素，可以提高RNA聚合酶活性，對蛋白質(zhì)與RNA的合成有一定的促進(jìn)作用[9]，同時可延緩動植物衰老、提高抗氧化酶活性、增強(qiáng)蛋白質(zhì)表達(dá)[10]。當(dāng)前國內(nèi)外對于施用外源亞精胺來緩解植物非生物脅迫已有一定的研究。李軍等[11]利用外源亞精胺緩解了鹽脅迫對黃瓜幼苗光合作用的抑制。王學(xué)等[12]通過施用外源亞精胺提高了荇菜對汞脅迫的耐受性。張潤花等[13]研究了外源亞精胺對鹽脅迫下黃瓜幼苗體內(nèi)抗氧化酶活性的影響。但有關(guān)外源亞精胺能否緩解杞柳鎘脅迫的相關(guān)研究尚鮮見報道。因此，本試驗采用營養(yǎng)液培養(yǎng)的方法，使用扦插培育的柳苗進(jìn)行試驗，研究鎘脅迫對杞柳生長與根系構(gòu)型的影響，確定鎘脅迫對杞柳的半抑制濃度，明確施用外源亞精胺對緩解杞柳鎘脅迫的作用及其生理機(jī)制，為應(yīng)用杞柳進(jìn)行鎘污染土壤的修復(fù)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試杞柳（Salix integra）取自山東省臨沂市莒南縣，其品種經(jīng)鑒定為大青葉，將其枝條采用扦插的方式于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗站進(jìn)行繁育保存，然后剪取枝條采用水培扦插的方式于溫室進(jìn)行試驗。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗于2018年8—9月于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室（31±5℃）進(jìn)行，采用營養(yǎng)液培養(yǎng)試驗，將去掉頂端嫩芽的杞柳枝條剪至15 cm長，放入盛有1/2 Hoagland營養(yǎng)液的水培箱中進(jìn)行扦插培育。培養(yǎng)至生長出3～5條不定根與葉片嫩芽之后，選取長勢一致的柳苗進(jìn)行試驗。將柳苗移至新的水培箱中，以1/2 Hoagland營養(yǎng)液處理作為對照（S0），其余處理使用1/2 Hoagland營養(yǎng)液并加入相應(yīng)濃度的CdCl2（分析純），Cd2+處理分別為 S10（10 mg·L-1Cd2+）、S20（20 mg·L-1Cd2+）、S30（30 mg·L-1Cd2+）、S40（40 mg·L-1Cd2+），每個處理3次重復(fù)。處理7 d后將植株樣品取出，測量生物量，計算相對生長率。

依據(jù)鎘脅迫下杞柳生物量的相關(guān)數(shù)據(jù)，通過SPSS中的IC50分析，得出鎘脅迫對杞柳的半抑制濃度，再選取長勢一致的柳苗進(jìn)行試驗。將柳苗移至另一個水培箱中，加入1/2 Hoagland營養(yǎng)液，同時加入CdCl2（分析純）使Cd2+濃度達(dá)到半抑制濃度，以不噴施亞精胺的處理作為對照（C0），亞精胺購自Sigma（貨號為S2626），亞精胺處理分別為C01（0.1 mmol·L-1）、C02（0.2 mmol·L-1）、C04（0.4 mmol·L-1）、C08（0.8 mmol·L-1）、C16（1.6 mmol·L-1）。采用葉面噴施的方式進(jìn)行處理，每盆每日噴施5 mL亞精胺溶液，連續(xù)噴施7 d，C0處理噴施清水，每個處理3次重復(fù)。處理結(jié)束后將植株樣品取出檢測。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 生物量與相對生長率

處理前后分別稱質(zhì)量，并計算相對生長率。

相對生長率=（鎘脅迫或亞精胺處理始末生物量差值/鎘脅迫或亞精胺處理初始生物量）/（對照處理始末生物量差值/對照處理初始生物量）

1.3.2 根系構(gòu)型

將根系放入根系掃描儀Epson V700的玻璃槽中，注入1 cm的去離子水使根系充分散開，將掃描獲取的圖像導(dǎo)入Win RHIZO根系分析系統(tǒng)中進(jìn)行分析獲取數(shù)據(jù)。

1.3.3 生理指標(biāo)

在處理完成之后，準(zhǔn)確稱取0.1 g植株葉片樣品置于預(yù)冷處理的研缽中，用液氮研磨后，加入9 mL生理鹽水，轉(zhuǎn)移到離心管中，4℃離心10 min，收集上清液用于生理指標(biāo)的測定。采用H2O2含量檢測試劑盒（A064-1）、蛋白定量測試盒（A045-2）、超氧陰離子試劑盒（A052）、GR分析試劑盒（A062）進(jìn)行檢測，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

試驗所用數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，使用Excel 2010進(jìn)行做圖和數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析（多重比較方法為Duncan），比較不同處理間差異的顯著性水平（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫對杞柳生長的抑制作用

鎘脅迫顯著抑制杞枊的生長，4個Cd2+處理（S10、S20、S30、S40）杞柳的相對生長率較 S0分別下降18.29%、38.02%、72.33%、75.38%（圖1）；S20顯著小于S10，同時S30、S40顯著低于S10和S20，但S30與S40之間差異不顯著。根據(jù)結(jié)果計算半抑制濃度，得出IC50為24.50 mg·L-1。雖然杞柳生長受到鎘脅迫的抑制，但當(dāng)Cd2+達(dá)到較高濃度時（30、40 mg·L-1），杞柳仍具有一定的相對生長率（24.62%～27.67%），表明杞柳對鎘脅迫具有較強(qiáng)的耐受性，且在應(yīng)用于鎘污染土壤修復(fù)方面潛力較大。

2.2 亞精胺對鎘脅迫下杞柳的影響

2.2.1 亞精胺對鎘脅迫下杞柳生長的影響

施用亞精胺對杞柳鎘脅迫具有一定的緩解作用，5個處理（C01、C02、C04、C08、C16）杞柳的相對生長率均顯著大于C0（圖2），其增長幅度分別為44.97%、85.48%、102.76%、89.83%、76.78%。C04處理顯著大于C01、C02、C08、C16處理，且C08和C16處理顯著大于C01處理，而與C02處理間差異未達(dá)顯著水平；同時，C08處理顯著大于C16處理，C02處理顯著大于C01處理。由此可知，C04處理（0.4 mmol·L-1）提高鎘脅迫下杞柳相對生長率的效果最好，且亞精胺對鎘脅迫的緩解效應(yīng)并不隨其濃度增大而增強(qiáng)。

圖1 不同鎘濃度處理下的杞柳相對生長率Figure 1 Relative growth rate of Salix integra under different cadmium treatments

2.2.2 亞精胺對鎘脅迫下杞柳根系構(gòu)型的影響

施用外源亞精胺可顯著緩解鎘脅迫對杞柳根系生長的抑制作用，但各根系指標(biāo)對亞精胺緩解作用的響應(yīng)濃度存在差異（圖3）。杞柳的根長、根系面積、表面積在C01濃度下就對亞精胺產(chǎn)生顯著響應(yīng)（圖4），且總根長與面積在C02處理時達(dá)到最高；C02、C04、C08處理根長、根系面積顯著大于C01和C16，且C16處理根系面積顯著大于C01（11.93%）處理；C02、C08、C16處理的根系表面積顯著大于C01處理，C02顯著大于C16；投影面積、平均直徑與根系體積在C02處理濃度即對亞精胺產(chǎn)生顯著響應(yīng)，在C04處理時達(dá)到最高（表面積也為最高），且C0與C01間差異不顯著；C04、C16分別與C02、C08之間根系投影面積差異不顯著，C04顯著大于C16，C02、C08間差異不顯著。綜上可知，亞精胺雖然顯著緩解了鎘脅迫對杞柳根系生長的抑制，并在C04處理時達(dá)到最佳效果，但其緩解作用同樣不隨施用濃度的進(jìn)一步提高而增強(qiáng)。

根系構(gòu)型是表征植物根系生長發(fā)育的重要指標(biāo)，C02、C04、C08、C16處理根系連接數(shù)、節(jié)點(diǎn)數(shù)、分叉數(shù)、根尖數(shù)顯著大于C0、C01處理（表1），且C01處理下節(jié)點(diǎn)數(shù)、連接數(shù)、根尖數(shù)顯著大于C0處理，分別提高了26.80%、4.88%、5.06%。C02、C04、C08、C16處理的分叉數(shù)間均無顯著差異；而C04處理的連接數(shù)顯著大于C02、C08、C16處理；C04、C08、C16處理節(jié)點(diǎn)數(shù)顯著大于C02處理；C02、C04處理根尖數(shù)顯著大于C16處理。連接數(shù)、節(jié)點(diǎn)數(shù)、根尖數(shù)在C01濃度就對亞精胺的緩解產(chǎn)生響應(yīng)，而分叉數(shù)則是在亞精胺濃度達(dá)到0.2 mmol·L-1（C02）后顯著響應(yīng)，連接數(shù)與根尖數(shù)對于高濃度的亞精胺更為敏感，在亞精胺濃度大于0.4 mmol·L-1（C04）后，其緩解效應(yīng)降低。

圖2 鎘脅迫下不同亞精胺處理杞柳相對生長率Figure 2 Relative growth rate of Salix integra treated with different spermidine levels under cadmium stress

圖3 鎘脅迫下不同亞精胺處理的杞柳根系掃描圖Figure 3 Root scanning of Salix integra treated with different spermidine levels under cadmium stress

圖4 鎘脅迫下不同亞精胺處理杞柳的根系生長情況Figure 4 Root growth of Salix integra treated with different spermidine levels under cadmium stress

2.2.3 亞精胺對鎘脅迫下杞柳總蛋白、谷胱甘肽還原酶、產(chǎn)生超氧陰離子活力單位和過氧化氫含量的影響

總蛋白是表征植物總代謝和生理活性的重要指標(biāo)。亞精胺顯著提高杞柳總蛋白含量（34.92%～117.46%），且C08、C16處理顯著大于C01、C02、C04處理，且C16處理顯著大于C08處理（圖5）。亞精胺處理顯著降低了谷胱甘肽還原酶（GR）、產(chǎn)生超氧陰離子活力單位和過氧化氫（H2O2）含量，C02、C04、C08和C16處理的GR活性顯著小于C01處理（降低了47.72%～73.90%），且C02、C04、C08和C16間差異不顯著。C08處理產(chǎn)生超氧陰離子活力單位顯著小于C01處理（降低了30.90%），而與其他亞精胺處理（C02、C04、C16）差異不顯著。C04處理H2O2含量顯著小于 C01、C02和 C16處理（降低了 23.38%～28.99%），而與C08處理間差異不顯著，且C01、C02、C08和C16間差異不顯著。因此，施加亞精胺通過降低過氧化物含量來緩解杞柳鎘脅迫，同時促進(jìn)了蛋白質(zhì)的合成，顯著提高了鎘脅迫下杞柳體內(nèi)的總蛋白含量。

表1 鎘脅迫下不同亞精胺處理杞柳根系構(gòu)型Table 1 Root configuration of Salix integra treated with different spermidine levels under cadmium stress

圖5 鎘脅迫下不同亞精胺處理的杞柳葉片酶活性Figure 5 Enzyme activity in leaves of Salix integra treated with different spermidine levels under cadmium stress

3 討論

杞柳因生長速率快、生物量高、易繁殖，同時其柳條去除表皮后可作為重要的編織材料，而被廣泛種植并應(yīng)用于工藝品編織。本研究表明，杞柳在40 mg·L-1的鎘溶液中仍能存活，其相對生長率為24.62%，表明杞柳應(yīng)用于鎘污染土壤修復(fù)具有巨大潛力。但在鎘脅迫下，杞柳生長也受到明顯的抑制（其相對生長率在24.50 mg·L-1的鎘脅迫營養(yǎng)液中下降50%），這又不利于其在鎘污染土壤修復(fù)中的廣泛應(yīng)用。因此，亟需尋找提高杞柳對鎘脅迫耐受性的強(qiáng)化措施。

亞精胺是植物體內(nèi)最常見的內(nèi)源激素之一，是植物代謝過程中產(chǎn)生的次類代謝多胺物質(zhì)。已有研究表明，施用外源亞精胺可提高植物對鹽脅迫、Hg2+脅迫的耐受性[13-15]。本試驗結(jié)果表明，施用外源亞精胺對于緩解杞柳所受鎘脅迫也具有十分明顯的作用，其相對生長率在0.4 mmol·L-1的亞精胺處理下較對照提高102.76%，顯著促進(jìn)杞柳根系的生長發(fā)育，增加其總根長、表面積、體積來提高根系吸收能力，促進(jìn)杞柳的生長。這與魏國芹等[14]研究報道的植物所受脅迫緩解后的根系變化相一致。

鎘脅迫會導(dǎo)致植物抗氧化能力的隱形喪失，影響植物抗氧化酶活性，增加H2O2的內(nèi)在積累進(jìn)而導(dǎo)致DNA和蛋白質(zhì)被破壞[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在1.6 mmol·L-1的亞精胺處理下，總蛋白含量達(dá)到20.15 g prot·L-1（較C0提高了117.46%），這主要是由于亞精胺具有促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成功能，所以在緩解杞柳所受鎘脅迫的同時，隨著亞精胺施加濃度的提高而不斷提高蛋白質(zhì)合成速率，導(dǎo)致總蛋白含量持續(xù)顯著上升[17]。這與杜長霞等[18]研究發(fā)現(xiàn)的亞精胺顯著提升鹽脅迫下黃瓜幼苗總蛋白含量的結(jié)果一致。此外，GR作為植物重要的抗氧化酶之一，是通過還原氧化型谷胱甘肽（GS-SG）為谷胱甘肽（GSH）而發(fā)揮抗氧化和解毒作用[19-21]。GSH可通過與重金屬螯合來緩解植物所受脅迫，當(dāng)鎘脅迫被緩解后，植物體內(nèi)的GSH與GS-SG重新達(dá)到平衡，表明施用亞精胺緩解了杞柳所受鎘脅迫，從而使得GR的活性下降。這與張騰國等[21]在逆境脅迫下的GR活性上升結(jié)果相印證。同時，在脅迫條件下，植物葉片會產(chǎn)生積累大量的超氧陰離子自由基，H2O2與超氧陰離子過量都會對植株造成組織損傷[22]。本試驗發(fā)現(xiàn)，0.4 mmol·L-1的亞精胺顯著緩解了杞柳鎘脅迫，其產(chǎn)生超氧陰離子活力單位與H2O2含量分別下降46.35%和67.39%。這與一氧化氮緩解水稻鑭脅迫的研究結(jié)果一致，在鑭脅迫下水稻葉片中的H2O2含量顯著增加，在施用一氧化氮緩解脅迫后，其H2O2含量顯著下降[23]；田保華等[24]的研究發(fā)現(xiàn)鎘脅迫下H2O2含量上升。究其原因，H2O2作為一種較為穩(wěn)定的活性氧，并不會直接造成膜脂的氧化，而超氧陰離子可通過（H2O2+O-2→OH+O2）反應(yīng)生成OH-對細(xì)胞膜脂產(chǎn)生過氧化作用，還會通過特異性點(diǎn)位攻擊導(dǎo)致DNA斷裂[25]，從而對植物產(chǎn)生毒害，而外源亞精胺的噴施通過降低產(chǎn)生超氧陰離子活力單位與H2O2含量，減輕了杞柳所受超氧陰離子與OH的過氧化危害，從而緩解了杞柳所受的鎘脅迫。

4 結(jié)論

（1）杞柳在鎘污染的修復(fù)中具有較強(qiáng)的潛力，在40 mg·L-1鎘濃度脅迫下仍保持較高的生長速率，其半抑制濃度為24.50 mg·L-1。

（2）施加亞精胺可有效緩解杞柳所受鎘脅迫，促進(jìn)其根系生長發(fā)育、提高總蛋白質(zhì)含量、降低超氧陰離子與過氧化氫含量。其中，施加0.4 mmol·L-1的外源亞精胺對緩解杞柳鎘脅迫效果最佳。