微波和超聲波輔助萃取廢棄煙葉及煙桿中煙堿的研究

王 瑩 ，楊海朝 ，劉鳳霞 ， 薛 剛 ，黃亞平

（1.南陽(yáng)理工學(xué)院，河南南陽(yáng) 473004；2.河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南南陽(yáng) 473004；3.河南順天生物科技有限公司，河南南陽(yáng) 473300）

煙堿是生產(chǎn)綠色食品理想的高效殺蟲(chóng)劑和生物性農(nóng)藥[1-2]，用途十分廣泛。在卷煙工業(yè)中用天然煙堿配制的香精具有顯著增加香氣和勁頭的作用，在葉組配方中減少了對(duì)上等煙葉的用量，降低了卷煙成本[3]。隨著煙草工業(yè)、精細(xì)化工、制藥、有機(jī)合成、國(guó)防、農(nóng)藥等的迅速發(fā)展，市場(chǎng)對(duì)煙堿的需求與日俱增。煙堿的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、溶劑萃取法、離子交換樹(shù)脂法、超臨界流體萃取法、液膜分離法等[4-7]。水蒸氣蒸餾法是提取天然煙堿較為原始的工藝，利用煙堿在堿性條件下能與水蒸氣共同揮發(fā)而不分解的特性[5]進(jìn)行提取，該方法流程簡(jiǎn)單、操作方便，但是會(huì)耗費(fèi)大量的能源、效率低。國(guó)內(nèi)外也有報(bào)道用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)從煙草中提取煙堿，該方法雖然提取率較高，但設(shè)備投資和維修費(fèi)用大、設(shè)計(jì)和制造技術(shù)要求高、生產(chǎn)能力低。溶劑萃取法是將煙葉浸泡后用石灰乳處理凈化，用Na2CO3去除殘存的Ca2+離子，澄清液用氯代烯烴、乙醚、氯仿、溶劑油等有機(jī)溶劑萃取，萃取液用硫酸洗脫，煙堿從有機(jī)相轉(zhuǎn)移到水相成硫酸煙堿，萃取液用硫酸洗脫，煙堿從有機(jī)相轉(zhuǎn)移到水相成硫酸煙堿，多次富集得硫酸煙堿產(chǎn)品。但該方法操作步驟復(fù)雜、萃取時(shí)間較長(zhǎng)，而且會(huì)產(chǎn)生大量廢水，為廢水處理帶來(lái)困難。

對(duì)于生產(chǎn)煙堿粗品來(lái)說(shuō)，最簡(jiǎn)單的就是酸性水提法，但傳統(tǒng)浸提法存在提取時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)，如果加以微波和超聲波輔助，可大大縮短提取時(shí)間。謝長(zhǎng)芹和陳麗金等人[6-7]以廢次煙葉為原料研究了微波法提取煙葉和煙末中煙堿的技術(shù)，周民杰和朱松等人[8-9]利用超聲波提取低次煙葉中煙堿。試驗(yàn)同時(shí)研究?jī)?yōu)化微波和超聲波輔助提取煙廢棄煙葉及煙桿中煙堿的工藝，為企業(yè)萃取煙堿提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

材料：河南省種植的廢棄煙葉和煙桿，河南順天生物科技有限公司提供。

試劑：氫氧化鈉、氯化鈉、硅鎢酸 鹽酸、98%濃硫酸等，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

儀器：BILON-2008型低溫超聲波萃取儀，上海比朗儀器有限公司產(chǎn)品；XH-MC-1型微波輔助反應(yīng)儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；752N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；TGL-16C型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；BSA224S-CW型電子天平，Sartorius中國(guó)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 廢棄煙葉及煙桿中煙堿含量及提取率的測(cè)定

（1）原料中煙堿含量測(cè)定。蒸餾時(shí)稱取1 g粉碎后的煙葉或煙桿于500 mL蒸餾瓶中，加入20 g NaCl和2 g NaOH，用30 mL水將煙桿沖下，立即將蒸餾瓶連接于水蒸氣蒸餾裝置進(jìn)行蒸餾。用內(nèi)含10 mL 1 mol/L H2SO4溶液的250 mL三角瓶作為接收器，冷凝管末端應(yīng)浸入H2SO4溶液中。蒸餾過(guò)程中蒸餾瓶?jī)?nèi)的液體體積應(yīng)保持恒定，必要時(shí)可適當(dāng)加熱。收集220～230 mL餾出液，用小試管取餾出液1 mL，加1滴濃度為2.4 mol/L的HCl溶液和1滴濃度為0.036 mol/L硅鎢酸溶液，不顯渾濁時(shí)可停止蒸餾。取下容量瓶，同時(shí)用水沖洗冷凝管末端，確認(rèn)容量瓶處于室溫。用水定容至刻度，搖勻。若餾出液不澄清，則將其過(guò)濾。

紫外分光光度法餾出液中總植物堿的含量：用移液管吸取10 mL的餾出液于50 mL容量瓶中，用濃度為0.025 mol/L的H2SO4溶液定容至刻度，以濃度為0.025 mol/L的H2SO4溶液作參比，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液在波長(zhǎng)236，259，282 nm處的吸光度。若259 nm處的吸光度超過(guò)0.7，應(yīng)取較小體積的餾出液重新稀釋測(cè)定。

煙堿含量的結(jié)果計(jì)算如下：

式中：F——稀釋倍數(shù)；

m——試樣質(zhì)量，g；

N——總質(zhì)量百分含量，%；

W——試樣的水分含量，%。

2次平行測(cè)定精確至0.01%，測(cè)定結(jié)果之差不大于0.05%。

（2）煙堿提取率計(jì)算。干廢棄煙葉或煙桿經(jīng)曬干、粉碎后，水浴浸提、過(guò)濾得濾液，濾液經(jīng)濃縮即得煙堿粗品，稱量，濃縮物再經(jīng)濃度為1 mol/L的硫酸溶液吸收后，取出10 mL濃縮液用濃度為0.025 mol/L的硫酸定容至50 mL，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度。計(jì)算公式如下：

式中：M——浸提液中濃縮物質(zhì)量，g；

X——濃縮物中煙堿含量，g；

M0——原料質(zhì)量，g；

X0——原料中煙堿含量，g。

1.2.2 煙堿提取的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）pH值對(duì)煙堿提取率的影響。稱取5份5.0 g粉碎的廢棄煙葉或煙桿，分別置于5個(gè)250 mL的錐形瓶中，在料液比1∶15，浸提溫度70℃，浸提時(shí)間2 h，浸提次數(shù)1次的條件下，向5個(gè)錐形瓶中各加入75 mL pH值分別為2，3，4，5，6的水溶液，在水浴振蕩搖床上振蕩萃取，得到的萃取液經(jīng)濃縮稀釋后，采用紫外分光光度法測(cè)定煙堿的吸光度，并利用公式（2）得出煙堿的提取率。

（2） 萃取時(shí)間對(duì)煙堿提取率的影響。稱取5份5.0 g粉碎的廢棄煙葉或煙桿，分別置于5個(gè)250 mL的錐形瓶中，再加入75 mL pH值為2的水溶液，在浸提溫度70℃，浸提次數(shù)1次的條件下，設(shè)定水浴萃取時(shí)間分別為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 h，在水浴振蕩搖床上振蕩萃取，得到的萃取液經(jīng)濃縮稀釋后，采用紫外分光光度法測(cè)定煙堿的吸光度，并利用公式（2） 得出煙堿的提取率。

（3） 萃取次數(shù)對(duì)煙堿提取率的影響。稱取4份3.0 g粉碎的廢棄煙葉或煙桿，分別置于4個(gè)250 mL的錐形瓶中，每次加入45 mL pH值為2的水溶液，70℃下在水浴振蕩搖床上振蕩萃取2 h，分別萃取1，2，3，4次，將每次萃取得到的萃取液合并經(jīng)濃縮稀釋后，采用紫外分光光度法測(cè)定煙堿的吸光度，并利用公式（2）得出煙堿的提取率。

（4） 料液比對(duì)煙堿提取率的影響。稱取5份3.0 g粉碎的廢棄煙葉或煙桿于5個(gè)250 mL的錐形瓶中，分別按 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30的料液比加入pH值為2的水進(jìn)行浸提，浸提溫度70℃，浸提時(shí)間2 h，浸提次數(shù)1次，得到的萃取液經(jīng)濃縮稀釋后，采用紫外分光光度法測(cè)定煙堿的吸光度，并利用公式（2）得出煙堿的提取率。

1.2.3 微波和超聲波輔助萃取煙堿的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用微波或超聲波輔助萃取做三因素三水平的優(yōu)化試驗(yàn)，從單因素試驗(yàn)中選出適當(dāng)反應(yīng)條件，對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，選取pH值、反應(yīng)時(shí)間、料液比3個(gè)因素，采用L9（34）正交表進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。其中，選定微波輔助功率400 W，輻射溫度65℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 廢棄煙葉和煙桿中煙堿含量的測(cè)定

根據(jù)水蒸氣蒸餾法測(cè)定干煙葉中煙堿的含量，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定餾出液中煙堿含量。

單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，單因素試驗(yàn)的方差分析見(jiàn)表2。

結(jié)果表明，河南豫煙的廢棄煙葉和煙桿中煙堿含量的平均值分別為1.583%和0.387%。

2.2 pH值對(duì)煙堿提取率的影響

表1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

表2 單因素試驗(yàn)的方差分析

分別選取不同pH值條件下的水溶液對(duì)廢棄煙葉和煙桿進(jìn)行浸提，置于70℃的水浴搖床上，浸提2 h后抽濾，濾液濃縮，測(cè)濃縮物的質(zhì)量及其煙堿含量，利用公式（2） 計(jì)算煙堿的提取率，結(jié)果見(jiàn)表1。以提取率為指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)方差分析可知，不同pH值之間差異達(dá)到顯著或極顯著水平（廢棄煙葉F=10.696**，煙桿F=4.8*）。pH值5和pH值4條件下廢棄煙葉及煙桿的提取率較高，它們之間差異不顯著（顯著性檢驗(yàn)略）。

2.3 萃取時(shí)間對(duì)煙堿提取率的影響

用pH值4的水溶液對(duì)廢棄煙葉和煙桿進(jìn)行浸提，分別選取不同的萃取時(shí)間，置于70℃的水浴搖床上，浸提后抽濾，濾液濃縮，測(cè)濃縮物的質(zhì)量及其煙堿含量，利用公式（2）計(jì)算煙堿的提取率（表1），當(dāng)萃取時(shí)間為1 h和2 h時(shí)提取率較高。以提取率為指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析（見(jiàn)表2）。由表2可知，不同提取時(shí)間下對(duì)廢棄煙葉煙堿提取率達(dá)到極顯著水平（F=13.465**），對(duì)煙桿煙堿提取率不顯著。

2.4 萃取次數(shù)對(duì)煙堿提取率的影響

用pH值4的水溶液對(duì)廢棄煙葉和煙桿進(jìn)行浸提，分別選取不同的萃取次數(shù)，每次萃取1 h，置于70℃的水浴搖床上，浸提后抽濾，濾液濃縮，測(cè)濃縮物的質(zhì)量及其煙堿含量，利用公式（2）計(jì)算煙堿的提取率（見(jiàn)表1）。以提取率為指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析（見(jiàn)表2）。

結(jié)果說(shuō)明，萃取次數(shù)2～3次提取率高；方差分析結(jié)果顯示，萃取次數(shù)差異達(dá)到極顯著水平（廢棄煙葉F=36.684**，煙桿F=13.222**），最好次數(shù)為2～3次。

2.5 料液比對(duì)煙堿提取率的影響

用pH值4的水溶液對(duì)廢棄煙葉和煙桿進(jìn)行浸提，分別選取不同的料液比，萃取1次，萃取時(shí)間為1 h，置于70℃的水浴搖床上，浸提后抽濾，濾液濃縮，測(cè)濃縮物的質(zhì)量及其煙堿含量，利用公式（2） 計(jì)算煙堿的提取率（見(jiàn)表1）。以提取率為指標(biāo)做單因素方差分析（見(jiàn)表2）。

由表1可知，料液比1∶25時(shí)提取率高。方差分析說(shuō)明料液比差異達(dá)到極顯著水平（廢棄煙葉F=136.079**，煙桿F=46.114**），最佳料液比1∶25。

2.6 正交試驗(yàn)

選取pH值、料液比、微波時(shí)間或超聲波時(shí)間3個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，利用微波或超聲波輔助萃取煙堿。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。采用公式（2）測(cè)定各組試驗(yàn)所得煙堿提取率。超聲波和微波輔助萃取煙堿的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

超聲波和微波輔助萃取的正交試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表4）說(shuō)明，從表觀上看微波輔助萃取提取率高于超聲波輔助萃取。極差分析結(jié)果是超聲波輔助萃取廢棄煙葉的最優(yōu)組合為A1B3C3，即pH值4，超聲時(shí)間180 s，料液比1∶25；超聲波輔助萃取煙桿的最優(yōu)組合為A2B3C3，即pH值5，超聲時(shí)間180 s，料液比1∶25；微波輔助萃取廢棄煙葉的最優(yōu)組合為A2B2C3，即pH值5，微波時(shí)間20 s，料液比1∶25；微波輔助萃取煙桿的最優(yōu)組合為A2B3C3，即pH值5，微波時(shí)間30 s，料液比1∶25。從最優(yōu)順序看均為B＞A＞C，說(shuō)明超聲波和微波輔助效果最好。

表3 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表4 超聲波和微波輔助萃取煙堿的正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表4

表5 正交試驗(yàn)的方差分析

正交試驗(yàn)的方差分析見(jiàn)表5。

由表5可知，超聲波和微波輔助萃取的B因素達(dá)到顯著水平，因此B因素應(yīng)該控制在最優(yōu)B3水平。盡管A因素不顯著，結(jié)合極差分析說(shuō)明，A因素應(yīng)為A2水平。C因素可以在選任何一個(gè)水平，為節(jié)省濃縮時(shí)間和濃縮能耗C因素應(yīng)在C1水平。最后確定最佳組合為A2B3C1，即pH值5，料液比1∶15，超聲時(shí)間180 s或微波時(shí)間20～30 s。

3 結(jié)論

（1）單因素試驗(yàn)表明，河南豫煙廢棄煙葉和煙桿中煙堿含量的平均值分別為1.583%和0.387%，低于云南和貴州。如要變廢為寶，應(yīng)綜合考慮煙油、煙浸膏等的提取。研究確定pH值5和pH值4條件下廢棄煙葉及煙桿的提取率較高。試驗(yàn)沒(méi)有設(shè)定堿性條件是因?yàn)樵趬A性條件下，煙堿為游離煙堿。當(dāng)萃取時(shí)間為1 h和2 h時(shí)提取率較高，萃取次數(shù)2～3次提取率高，最佳料液比1∶25。

（2） 超聲波和微波輔助萃取的正交試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波和微波輔助萃取的效果達(dá)顯著，通過(guò)極差分析和方差分析確定最佳組合均為A2B3C1，即pH值5，料液比1∶15，超聲時(shí)間180 s或微波時(shí)間20～30 s。