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    小龍蝦疾病的病原檢測

    2019-10-23 06:18:52宮子慧
    漁業(yè)致富指南 2019年19期
    關(guān)鍵詞:瓊脂小龍蝦胰腺

    宮子慧

    近年來,克氏原螯蝦(俗稱小龍蝦)的消費量不斷增加,人工養(yǎng)殖面積持續(xù)擴大,泗洪縣小龍蝦的養(yǎng)殖模式主要以稻蝦綜合種養(yǎng)為主。2018年5月起,我縣部分養(yǎng)殖戶的小龍蝦出現(xiàn)死亡,病蝦主要表現(xiàn)為頭胸甲易剝離、肝胰腺顏色淡黃、螯肢及附肢無力、反應(yīng)遲鈍、應(yīng)激能力較弱、在頭胸甲部位常出現(xiàn)白斑。筆者通過對病蝦肝胰腺的細菌分離及鑒定,和PCR法分子檢測技術(shù)來探討引起小龍蝦發(fā)病的原因。

    1 材料與方法

    1.1 樣本來源

    病蝦樣本來自泗洪縣青陽鎮(zhèn)、曹廟鄉(xiāng)、孫園鎮(zhèn)、城頭鄉(xiāng)等鄉(xiāng)鎮(zhèn)的6個發(fā)病的養(yǎng)殖塘口,樣本的采樣編號、采集時間及地點見表1。

    表1 小龍蝦病樣采集信息

    表2 鑒定試劑條檢測結(jié)果

    表3 2株細菌對8種抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)對照表 mg/L

    1.2 方法

    1.2.1 病原菌的分離、鑒定及藥敏試驗

    用滅菌棉簽蘸取小龍蝦肝胰腺,均勻涂于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上和TCBS培養(yǎng)基上,分別置于28℃、37℃恒溫培養(yǎng)18-24h后,觀察菌落形態(tài),并挑取可疑單個菌落劃線接種在營養(yǎng)瓊脂平板和3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上,分別置于28℃、37℃恒溫培養(yǎng)18-24h。

    挑取純化過的細菌制成0.5麥氏單位的菌懸液,采用腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒(比色法)系統(tǒng)測定各分離菌株生理生化特性,同時做氧化酶反應(yīng)構(gòu)成第21個試驗,并用南京菲恩醫(yī)療科技有限公司的動物用藥敏分析試劑板進行藥敏試驗。

    1.2.2 WSSV 核酸提取及檢測

    從病蝦中取約100mg鰓組織,按照生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒的說明進行DNA提取,對WSSV DNA樣本采用《GB /T 28630.2-2012白斑綜合征( WSD)診斷規(guī)程第2部分套式PCR 檢測法》為標準進行檢測。PCR擴增體系總量為50μL,分別為:25μL Mix Taq酶( Takara),18μL無菌水,1 μL正向引物,1 μL反向引物,5μL模板。PCR產(chǎn)物通過用50×TAE電泳緩沖液配制的1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

    圖 3 WSSV PCR檢測結(jié)果

    2 結(jié)果

    2.1 病原菌的鑒定藥敏試驗

    從小龍蝦肝胰腺分離到的細菌在營養(yǎng)瓊脂平板上為光滑、濕潤、微凸、淡黃色菌落,在TCBS上呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落。對分離的2株細菌進行生理生化檢測,結(jié)果判定:分別為嗜水氣單胞菌和霍亂弧菌,具體生理生化特性見表 2。

    2.2 病原菌的藥敏試驗結(jié)果

    2株細菌對8種抗菌藥物的最小抑菌濃度如表3所示。

    參照2013年抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準,嗜水氣單胞菌對紅霉素為耐藥,對其他7種抗菌藥物均敏感,霍亂弧菌對紅霉素為中敏,對其他7種抗菌藥物均敏感。

    2.3 WSSV PCR檢測結(jié)果

    PCR檢測結(jié)果顯示病蝦WSSV病毒陽性檢出率為100%,如圖3所示。

    M∶DNA Marker(自上到下依次為2000、1000、750、500、250、100bp);1.陽性對照;2.陰性對照;3.采樣編號SH18050301;4.采樣編號4SH18050302;5.采樣編號SH18050303;6.采樣編號SH18050304;7.采樣編號SH18060601;8.采樣編號SH18060602

    3 討論與分析

    從生病小龍蝦肝胰腺分離到的2個細菌,根據(jù)其培養(yǎng)后的菌體形態(tài)特征、生化特性分析結(jié)果,分別確定為嗜水氣單胞菌和霍亂弧菌。通過藥敏試驗表明兩種菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸土霉素、強力霉素均敏感。

    PCR結(jié)果表明所有小龍蝦中都感染了WSSV(白斑綜合征病毒)。WSSV為一種無包涵體病毒,地理分布廣,流行范圍大,傳染性強,對發(fā)病蝦致死時間短,目前尚無有效的治療藥物,還不能有效地控制疫情,因此在小龍蝦養(yǎng)殖過程中應(yīng)加強疾病的預(yù)防??刂坪侠淼姆琶缑芏龋?guī)格200尾左右/kg的蝦苗畝均放養(yǎng)量不超過30kg,苗種健康,養(yǎng)殖過程中加強飼料投喂,提早投喂精飼料,顆粒飼料蛋白含量36%以上,提高蝦的抗病力,調(diào)控好水質(zhì),定期潑灑氯制劑或碘制劑進行水體消毒,移植培育好水草,營造良好的池塘環(huán)境,同時每7-10天使用過硫等底改產(chǎn)品改善養(yǎng)殖池底環(huán)境,定期內(nèi)服黃芪多糖等增強免疫力的產(chǎn)品。如果在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)死蝦,應(yīng)認真處理好死亡的病蝦,在遠離養(yǎng)殖塘處掩埋病蝦,杜絕病毒的進一步擴散。

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