玻璃管動物標簽標志曼氏無針烏賊幼體的效果初探

董智勇，劉立芹， 龔理， 劉炳艦，江麗華，遲長鳳，呂振明*

(1.海洋生物種質(zhì)資源發(fā)掘利用國家地方聯(lián)合工程實驗室，海洋科學與技術學院，浙江海洋大學； 2.國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術研究中心，浙江海洋大學： 浙江 舟山 316022)

曼氏無針烏賊(Sepiellajaponica)是中國重要的海洋頭足類生物，屬軟體動物門(Mollusca)、頭足綱(Cephalopoda)、十腕目(Decapoda)、烏賊科(Sepiidae)、無針烏賊屬(Sepiella)，是中國傳統(tǒng)的海洋漁業(yè)資源[1]。20世紀70年代，中國曼氏無針烏賊的歷史最高漁獲量僅浙江省便達6萬 t，占當時浙江捕撈漁業(yè)總產(chǎn)量的9.3%，曼氏無針烏賊因而成為著名的東?！八拇蠛．a(chǎn)”之一[1]。但70年代末以來，由于過度捕撈和水域條件遭破壞，中國的曼氏無針烏賊漁業(yè)資源衰退嚴重，至目前已無法形成漁汛，自然資源已近枯竭[2]。為保護中國曼氏無針烏賊自然資源，國內(nèi)科研工作者開展了系列工作，并于21世紀初突破了曼氏無針烏賊的人工繁育技術瓶頸，隨后其規(guī)?；斯ぴ鲋澈唾Y源養(yǎng)護工作也在中國沿海陸續(xù)展開，并取得了初步成效[3]。但至今，中國尚未能對已堅持多年的曼氏無針烏賊增殖放流和資源養(yǎng)護工作的實際效果進行有效評估，其根本原因是尚未形成一套有效的曼氏無針烏賊的標志放流技術體系，因此，開展曼氏無針烏賊標志方法的研究已迫在眉睫。

當前，國際社會已開展了多種在海洋頭足類增殖標志方法方面的研究。其中，體外物理標記法、化學標記法及電子標簽法等傳統(tǒng)標志技術在海洋頭足類中均有所應用[4]。但相對而言，物理標記法具有標記保存率低、標記過程易造成機體損傷等缺點；化學標記法也存在識別困難、標記檢測時需殺死個體等不足，在海洋頭足類方面的運用已逐漸減少[4]。而電子標簽法具標記容易識別、保存率高和低損傷等優(yōu)點，已逐步在海洋頭足類標志中得到廣泛的運用[4]。如Anderson等[5]采用無源應答器標志法(PIT tag)在實驗室和野外條件下對郁蛸(Octopustetricus)和毛利蛸(Octopusmaorum)進行標志，結(jié)果表明，實驗期內(nèi)(室內(nèi)持續(xù)14個月；野外持續(xù)13個星期)兩種蛸體內(nèi)電子標簽的保存率均為100%，且標志后對蛸的生長和存活均無明顯影響，證明無源應答器標志是一種較為有效的頭足類標記方法； Scheel等[6]采用聲吶發(fā)生器(sonar transmitter)標志在野外條件下對40尾水蛸(Enteroctopusdofleini)進行標記，結(jié)果表明，水蛸在88 d的實驗期中對聲吶發(fā)生器標記的保存率為83%，并可實時記錄水蛸完整的活動軌跡和遷移過程，是非常理想的頭足類標志方法。然而，電子標簽標記法至今未在曼氏無針烏賊個體標志中得到運用，僅見Jiang等[7]及董智勇等[8]采用四環(huán)素、茜素絡合物等熒光標記法對曼氏無針烏賊進行了標志?；谏鲜銮闆r，本研究擬采用玻璃管動物標簽法對曼氏無針烏賊幼體進行標志，研究其標志效果及其對曼氏無針烏賊行為、生長及存活率等的影響，旨在探索建立一種適于曼氏無針烏賊的電子標簽標志方法，為今后曼氏無針烏賊增殖放流的效果評估及放流工藝的優(yōu)化提供支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

標志用曼氏無針烏賊幼體采自浙江海洋大學校級實驗基地(東極苗種繁育中心)自培育烏賊苗種，當幼體長至40日齡，胴長2.63～2.88 cm，體重3.47～4.69 g時，隨機挑選健康苗種220尾，用于后續(xù)的標志實驗。標志用玻璃管動物標簽及配套檢測設備購于廣州洪騰條碼技術公司，標簽型號為HT157，規(guī)格為1.5 mm×7.0 mm。

1.2 實驗方法

1.2.1 烏賊的麻醉

為避免標志過程中烏賊幼體發(fā)生噴墨死亡，標記前參照Wearmouth等[9]的方法將烏賊幼體進行麻醉，具體方法是：將烏賊幼體移入50 L含1.9%的MgCl2·6H2O海水溶液中，3～5 min后烏賊即麻醉失去平衡，待烏賊完全喪失對外界刺激的反應時即可進行后續(xù)的標志操作過程。

1.2.2 烏賊的標志

將玻璃管動物標簽及配套的注射針頭用酒精棉球消毒后，將標簽裝入注射器針頭內(nèi)，以15°～ 45°將針頭從烏賊背部刺入內(nèi)殼包膜下，推動注射器將玻璃管動物標簽植入內(nèi)殼包膜內(nèi)，緩慢拔出針頭，注射針孔處用酒精棉球消毒后即標志完畢。標志過程最好在烏賊麻醉后3～5 min內(nèi)完成，以免麻醉時間過長造成烏賊復蘇困難，共標志烏賊幼體110尾。實驗同時設對照組，將110尾對照組烏賊麻醉，并用無標簽的空載注射針頭扎入內(nèi)殼膜下，但無動物標簽注入，其他操作過程同標記組。

1.2.3 標志后管理

將標志好的烏賊幼體直接投入盛有清潔海水的養(yǎng)殖池中，加大養(yǎng)殖池水的氧氣充氣量，數(shù)分鐘后烏賊幼體即能逐步復蘇。將成功復蘇的104尾帶有標簽的標記組樣品與97尾無標簽的對照組樣品在同等條件下進行養(yǎng)殖，養(yǎng)殖水溫為26～28 ℃，鹽度為25～32，以鮮活野雜魚或野雜蝦為餌料進行投喂，日投喂量為烏賊體重的20%，每日投喂2次為宜，正常進行吸污及其他日常養(yǎng)殖管理。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

養(yǎng)殖過程中，每日記錄標記組和對照組烏賊的死亡情況，統(tǒng)計累積死亡率，檢查標記組的標簽保持情況，標簽檢測時采用肉眼觀測和標志閱讀器讀碼自動識別相結(jié)合的方法進行，讀碼時將標志閱讀器靠近烏賊7～10 cm處，即可讀取烏賊體內(nèi)標簽的編碼。同時在標志后0、10、20、30、40和50 d(已至成體)時采集烏賊樣品，分別測量標記組和對照組烏賊的全長、胴長、胴寬、體重、殼長、殼寬及殼重等生長性狀參數(shù)，計算瞬時生長率(IGR)，分析烏賊的生長情況，IGR=(lnw2-lnw1)/(t2-t1)×100%，其中w2和w1分別為t2日齡(d)和t1日齡(d)時的烏賊體重(g)，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件比較標記組和對照組在死亡率和生長指標上的差異，并對差異的顯著性進行T檢驗(Student′s t test，生長指標)和卡方檢驗(χ2，死亡率)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標志效果與保持率

將玻璃管動物標簽(圖1A)注入曼氏無針烏賊內(nèi)殼包膜下，烏賊背部在標簽注射部位旋即形成一突出隆起，注入初期，由于烏賊幼體皮膚較薄而透明，內(nèi)殼包膜下的玻璃管動物標簽仍隱約可見(圖1B)。但隨著烏賊個體的生長，玻璃管動物標簽逐步被增生的皮膚、肌肉和包膜組織掩蓋(圖1C)。標志40 d時，烏賊體內(nèi)的玻璃管動物標簽甚至被新形成的內(nèi)殼組織所包裹，逐步嵌入內(nèi)殼而成為內(nèi)殼中的一部分(圖1D)。即便如此，烏賊背部玻璃管動物標簽包埋而形成的隆起仍十分清晰可見。但由于標簽的規(guī)格和尺寸較小，在整個實驗過程中未見其對烏賊幼體行為活動產(chǎn)生明顯影響，烏賊能正?；顒印z食和生長。實驗過程中未發(fā)現(xiàn)標記脫落的情況，實驗結(jié)束時，烏賊體內(nèi)標簽的保持率達100%，該結(jié)果與無源應答器標記(PIT tags)[5,10]、檔案式標簽(archival tags)[9]等電子標簽標志海洋頭足類的效果及標記保持率相當，且大大高于植入式熒光數(shù)字標記(visible implant alphanumeric tags)[11]、彼得遜盤(petersen discs tags)[12]等體外物理標志對海洋頭足類的標記效率和保持率。標記后的曼氏無針烏賊在靠近掃描閱讀器7～12 cm范圍內(nèi)時，可準確讀取玻璃管動物標簽的編碼。該結(jié)果表明，玻璃管動物標簽具有標志效果好、識別簡便及保持效率高等優(yōu)點，是一種較為理想的烏賊增殖放流標志。

圖1 玻璃管動物標簽法標記曼氏無針烏賊的效果A為玻璃管動物標簽；B為標簽的埋植；C為標記后的烏賊；D為內(nèi)殼膜下的動物標簽。Fig.1The effects of tagging on Sepiella japonica juveniles with animal glass tube tagsA：animal glass tube tags used; B：the implant process of the tags; C：Sepiella japonica with tags； D：the implanted tags in the cuttlebones of Sepiella japonica.

2.2 標志對烏賊生長發(fā)育的影響

標志后的曼氏無針烏賊仍保持較為迅速的生長速率，50 d后即可達成體規(guī)格，瞬時生長率可達5.93%/d，該生長速率與前人測定的正常養(yǎng)殖條件下的烏賊生長速率相當[13]。對標記組和對照組烏賊的生長情況進行比較，結(jié)果表明，在7個主要生長性狀參數(shù)上，除30 d時的全長、殼寬及50 d時的全長等少數(shù)指標外，標記組和對照組烏賊生長均無顯著性差別(P>0.05)(表1，圖2)，且標記組和對照組曼氏無針烏賊在標志50 d后均可達性成熟，推測所用的HT157型玻璃管動物標簽規(guī)格較小，對標志個體的活動、攝食等行為影響小。類似的結(jié)果也在植入式熒光數(shù)字標記法(visible implant alphanumeric tags)標志銀磷烏賊(Sepioteuthissepioidea)[14]、無源應答器(PIT tags)標記法標志真蛸(Octopusvulgaris)[10]中有發(fā)現(xiàn)。值得注意的是，從表1和圖2的數(shù)據(jù)分析，標記組在幾乎所有生長性狀參數(shù)上均略高于對照組，盡管絕大多數(shù)未達統(tǒng)計學意義上的顯著性差異，但在一定程度上提示了還有必要進一步優(yōu)化玻璃管動物標簽的規(guī)格及埋植部位，以最大限度地降低標志對烏賊生長發(fā)育的潛在影響。

2.3 標志對烏賊存活率的影響

本研究還對標記組和對照組曼氏無針烏賊存活情況進行了為期50 d(已至成體)的跟蹤統(tǒng)計，結(jié)果表明，玻璃管動物標簽標志并未對烏賊的存活率產(chǎn)生明顯影響。從累積死亡率來看，50 d的養(yǎng)殖中，標記組和對照組曼氏無針烏賊的累積死亡率分別為21.15%和17.53%，經(jīng)卡方檢驗兩者間未呈現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)(表2)，在部分時間點上，如第10天和第40天時標記組的累積死亡率甚至低于對照組；從階段性死亡率來看，標志后短期損傷可能較大的前期(第0～20天)的死亡率也與后期(第20～50天)的死亡率相當，因此實驗過程中曼氏無針烏賊的死亡可能更多來源于養(yǎng)殖過程中的自然死亡，且死亡率與平洪領等[13]室內(nèi)養(yǎng)殖條件下獲得的曼氏無針烏賊的死亡率相當。較高的標志存活率在其他海洋頭足類中也多有發(fā)現(xiàn)，如Estefanell等[10]采用無源應答器標記法(PIT tags)標志真蛸獲得了46.4%～100%的存活率；Anderson等[5]采用同樣的方法標志郁蛸(Octopustetricus)和毛利蛸(Octopusmaorum)獲得了100%的存活率；前期本課題組采樣背部內(nèi)殼膜下注射茜素絡合指示劑的方法標記曼氏無針烏賊也獲得了81.63%的較高存活率[8]。本研究采用玻璃管動物標簽標志曼氏無針烏賊成活率較高的原因，一方面可能是由于標志時所用的針頭及標簽規(guī)格較小，在注射時不會造成肌肉和皮膚大面積損傷，減少了因繼發(fā)性感染而引起的死亡；另一方面則是由于海洋頭足類本身有較強的損傷后自愈能力，Wearmouth等[9]研究了檔案式標簽法標志商烏賊(Sepiaoffificinalis)后的愈合能力，結(jié)果表明：標志過程中，商烏賊背部形成的直徑2.8 mm、深5 mm的標志位點在一個月后即完全愈合，且未出現(xiàn)任何感染跡象，可見海洋頭足類的自愈能力較強。本實驗的研究結(jié)果進一步證實了玻璃管動物標簽法是一種低損傷的頭足類標志方法，在今后曼氏無針烏賊大規(guī)模標志放流中具有較好的潛在運用價值。

表1 玻璃管動物標簽標記對曼氏無針烏賊生長的影響Tab.1 The effect of animal glass tube tagging on growth performance of Sepiella japonica

注：表中數(shù)據(jù)右上標不同字母代表對照組與標記組差異顯著(P<0.05)?！啊北硎緹o具體數(shù)據(jù)。

表2 玻璃管動物標簽標記對曼氏無針烏賊存活率的影響Tab. 2 The effect of animal glass tube tagging on survival rate of Sepiella japonica

圖2 玻璃管動物標簽標記對曼氏無針烏賊生長的影響(n=6)A：標記對烏賊全長、胴長和胴寬的影響；B：標記對烏賊殼長和殼寬的影響；C：標記對烏賊體重的影響；D：標記對烏賊殼重的影響。Fig.2 The effect of animal glass tube tagging on growth performance of Sepiella japonica(n=6)A:The effect of tagging on total length, body length and body width of Sepiella japonica; B:The effect of tagging on shell length and shell width of Sepiella japonica; C:The effect of tagging on body weight of Sepiella japonica; D:The effect of tagging on shell weight of Sepiella japonica.

3 結(jié)論

玻璃管動物標簽法可有效應用于曼氏無針烏賊幼體的標志中。本研究將玻璃管動物標簽植入曼氏無針烏賊幼體內(nèi)殼包膜下后，可在其背部標簽所在位置形成突出的隆起，易識別，且在靠近標簽7～12 cm范圍內(nèi)通過閱讀掃描器快速準確識讀。標志后，烏賊體內(nèi)的玻璃管動物標簽被新形成的內(nèi)殼組織所包裹，逐步嵌入內(nèi)殼而成為內(nèi)殼中的一部分，從幼體至成體50 d內(nèi)的標志保存率為100%。玻璃管動物標簽標志對烏賊的行為活動、生長和存活均無顯著性影響(P>0.05)。玻璃管動物標簽在今后曼氏無針烏賊及其他海洋頭足類生物的大規(guī)模標志放流中具有較大的潛在應用價值。