CdSe/CdS量子點熒光探針測定蔬菜中滅蠅胺的殘留量

譚華東，趙淑巧，武春媛*

(1.中國熱帶農業(yè)科學院 環(huán)境與植物保護研究所，海南 ?？?571101；2.農業(yè)農村部儋州農業(yè)環(huán)境科學觀測實驗站，海南 儋州 571737；3.海南省熱帶生態(tài)循環(huán)農業(yè)重點實驗室，海南 ?？?571101)

滅蠅胺(Cyromazine，Cyr)，又名環(huán)丙氨嗪，化學名為N-環(huán)丙基-1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺，是一種三嗪類昆蟲生長調節(jié)劑，可誘導昆蟲形態(tài)發(fā)生畸變，主要用于葉菜類、菜豆類和瓜果類的美洲斑潛蠅、潛葉蠅防治。Cyr不易發(fā)生水解(pH為5～9)，可被光降解，但主要產物三聚氰胺被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為2B類致癌物。在動植物體內，Cyr可經脫烷基化轉化為三聚氰胺[1-2]。動物毒理實驗表明，Cyr及代謝產物的毒性具有明顯的劑量-效應關系，會損害動物健康，引起體重降低、肝腫大、血紅蛋白及血細胞數(shù)減少等問題，甚至導致動物胎兒骨骼發(fā)育遲緩，存活率下降[3-4]。在果蔬種植中，Cyr的不規(guī)范、過量使用易使其殘留于果蔬中，進而危及人體健康。因此，許多國家、國際組織制定了Cyr在農產品中的最大殘留限量值(MRL)，其中我國規(guī)定Cyr在菜豆、黃瓜中的MRL分別為0.5、1.0 mg/kg，歐盟、美國和日本規(guī)定其在果蔬中的MRL為0.05～0.5 mg/kg[5-8]。

目前，Cyr的檢測方法有氣相色譜-質譜法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)[9-11]。但GC-MS法需進行衍生化，檢測過程較繁瑣；HPLC、LC-MS/MS法易受基質干擾，前處理操作要求高、費時，需使用大型儀器，且溶劑用量大，易污染環(huán)境。因此，建立一種快速簡便、靈敏度高、選擇性好的Cyr檢測方法具有重要的現(xiàn)實意義。

熒光量子點(QDs)因光學性質優(yōu)異、檢測靈敏、簡便，而在環(huán)境檢測領域得到了廣泛應用[12-15]。本研究基于Cyr在弱酸性條件下使CdSe/CdS量子點(CdSe/CdS QDs)發(fā)生熒光增強的特性[12,16-17]，以巰基乙酸(TGA)為穩(wěn)定劑制備CdSe/CdS QDs，以此建立了快速、靈敏檢測蔬菜中Cyr的新方法。該方法具有靈敏度高、選擇性好、操作簡便等優(yōu)點，實際檢測應用中結果滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-97 Pro熒光分光光度計(上海棱光技術有限公司)；JEM 1400EX透射電子顯微鏡(日本日立儀器公司)；UV-2600/Shimadzu UV-Vis分光光度計(日本島津儀器公司)；FiveEasy plus pH計(梅特勒-托利多(上海)有限公司)；Keezo KMS-181E加熱恒溫磁力攪拌器(精鑿科技(上海)有限公司)；JJ-2B組織搗碎勻漿機(上海諾頂儀器設備有限公司)；三口燒瓶回流裝置(四川蜀玻(集團)有限責任公司)。

甲醇(CH3OH)、醋酸(CH3COOH，HAc)、醋酸鈉(CH3COONa，NaAc)、亞硫酸鈉(Na2SO3)、硒粉(Se)、醋酸鎘(Cd(CH3COO)2·2H2O)、硫化鈉(Na2S·9H2O)、氫氧化鈉(NaOH)、巰基乙酸(C2H4O2S，TGA，>91%)購于阿拉丁試劑公司。所用試劑為分析純及以上純度，均未經純化直接使用；實驗用水為去離子水；所有實驗均在室溫下完成。采用pH 5.6的HAc-NaAc緩沖溶液配制QDs溶液及Cyr標準溶液。

1.2 CdSe/CdS QDs的合成

CdSe/CdS QDs的合成基于文獻[18]所述方法并進行調整。首先，向20 mL 1.2 mol/L Na2SO3水溶液中加入0.015 mol Se粉，磁力攪拌作用下，在水浴鍋中將溶液緩慢加熱至75 ℃，充分攪拌至呈黃色、透明Na2SeSO3溶液；然后，將1 mL TGA加入200 mL含有0.022 5 mol Cd2+的Cd(CH3COO)2水溶液中，通過NaOH調節(jié)溶液的pH值至10～11，在N2保護下迅速加入上述Na2SeSO3溶液。將溶液緩慢加熱至100 ℃，并在N2保護下回流6 h以上，隨后自然冷卻至室溫，停止N2保護，得紅色溶膠。

攪拌該紅色溶膠，并緩慢加熱至40～50 ℃。同時，緩慢、交替地分5次加入0.05 mol/mL Na2S溶液和0.02 mol/mL Cd(CH3COO)2溶液(摩爾比CdS∶CdSe=4∶1)，在N2保護下回流6 h以上；再以7 500 r/min離心5 min，將沉淀分離后，即得橙紅色CdSe/CdS QDs。

1.3 樣品處理

采用組織攪碎機將新鮮蔬菜樣品攪碎，充分混勻，于-19 ℃冰柜中冷凍保存?zhèn)溆?。準確稱取25 g(精確至0.01 g)樣品，置于250 mL錐形瓶中，加入50 mL CH3OH，超聲10 min后用布氏漏斗過濾，用CH3OH洗滌燒杯和布氏漏斗，同時采用30 mL CH3OH提取濾紙，合并所有提取液至平底燒瓶中，減壓濃縮至50 mL后，以HAc-NaAc緩沖溶液調至pH 5.6左右，轉入100 mL容量瓶中，用水定容至100 mL，于-4 ℃冷藏備用。

1.4 Cyr的檢測條件

取5.0 μL 0.1 mol/L CdSe/CdS QDs溶液置于10 mL比色管中，加入1 mL不同濃度的蔬菜基質匹配標準溶液，以HAc-NaAc緩沖溶液定容，制得濃度為5.0～120 nmol/L的蔬菜基質匹配標準工作溶液。對于蔬菜樣品，測定時加入1 mL “1.3”的樣品溶液于10 mL 0.5 mmol/L CdSe/CdS QDs溶液中。在室溫條件下混勻反應8.0 min，以優(yōu)化的波長測定體系的熒光強度。測試條件為：激發(fā)狹縫寬度為20.0 nm，發(fā)射狹縫為10.0 nm，激發(fā)波長為481 nm，發(fā)射波長掃描范圍為500～750 nm。

2 結果與討論

2.1 CdSe/CdS QDs的光譜特性

圖1為CdSe/CdS QDs的透射電鏡(TEM)、紫外-可見吸收光譜(UV-Vis)和熒光光譜。由圖1a可觀察到CdSe/CdS QDs呈近似球形，且粒徑分布較均勻，平均粒徑約為3.0 nm。由圖1b可見，CdSe/CdS QDs 的UV-Vis吸收峰位于515 nm處，依據(jù)紫外吸收光譜經驗公式[19]：D=(9.812 7×10-7)λ3-(1.714 7×10-3)λ2+1.006 1λ-194.84(其中D為粒徑，λ為最大紫外吸收波長)，計算得CdSe/CdS QDs的粒徑為2.6 nm，與TEM表征結果較吻合。由圖1c可見，激發(fā)波長為481 nm時，CdSe/CdS QDs的熒光峰位于580 nm，峰形尖銳、平滑且對稱，半峰寬較窄(約為40.0 nm)，表明CdSe/CdS QDs的發(fā)光性能好，表面平滑缺陷少，且分散均勻。

2.2 測定原理

在中性的HAc-NaAc緩沖溶液中，CdSe/CdS QDs表面的TGA小部分(為0.04%)以—OOH形式存在，大部分(99.96%)以—OO-形式存在，因此其表面的TGA帶有大量—OO-，QDs之間表面電荷產生的排斥作用使其能夠以穩(wěn)定的粒徑形態(tài)存在；而在弱酸性(pH 5.6)條件下，TGA因質子化作用恢復成巰基基團進而破壞了Cd2+-TGA-QDs結構，使得TGA從CdSe/CdS QDs表面脫落[20-21]。同時，CdSe/CdS QDs表面裸露增加，團聚增多，導致CdSe/CdS QDs的熒光強度有所減弱。Wang等[22]研究表明，酸性條件下三聚氰胺可顯著增強CdS QDs的熒光強度，推測是由于三聚氰胺中的氨基可與CdS QDs表面的Cd存在配位作用，進而占據(jù)TGA電離形成的空位，不利于CdS QDs團聚所致。元曉云等[12]發(fā)現(xiàn)鏈霉素中的氨基也可以占據(jù)CdTe QDs上TGA脫落形成的空位，使得CdTe QDs分散，熒光顯著增強。Cyr的結構中也具有氨基官能團，使其可與CdSe/CdS QDs表面上的Cd發(fā)生配位作用，不利于CdSe/CdS QDs的團聚，進而能夠增強CdSe/CdS QDs的熒光強度。

2.3 CdSe/CdS QDs濃度的選擇

在體系pH 5.6條件下，考察了CdSe/CdS QDs濃度(0.01～10 mmol/L)對含50 nmol/L Cyr的蔬菜基質匹配溶液熒光強度的影響。結果顯示，當CdSe/CdS QDs的濃度大于5.0 mmol/L時，溶液體系的熒光強度過強，若Cyr濃度較低(5.0～50 nmol/L)時，相對熒光強度變化較小，使得檢測靈敏度低；當CdSe/CdS QDs的濃度低于0.05 mmol/L時，溶液體系的熒光強度較低，極少量的目標物即可使溶液體系的熒光強度顯著變化，檢測靈敏度提高，但線性范圍變窄。而CdSe/CdS QDs的濃度在0.1～1.0 mmol/L范圍內可獲得較好的靈敏度和線性范圍，進一步研究發(fā)現(xiàn)當濃度為0.5 mmol/L時，可使線性范圍跨越2個數(shù)量級，檢出限亦達到最佳。因此，后續(xù)實驗選用0.5 mmol/L的CdSe/CdS QDs。

圖2 溶液體系pH值對Cyr增強CdSe/CdS QDs熒光強度的影響Fig.2 Effect of pH value in solution on fluorescence enhancement of CdSe/CdS QDs in the presence of Cyr concentration of CdSe/CdS QDs：0.5 mmol/L;concentration of Cyr：50 nmol/L;reaction time:8.0 min

2.4 pH值的影響

在CdSe/CdS QDs、Cyr的濃度分別為0.5 mmol/L、50 nmol/L條件下，考察了HAc-NaAc溶液體系pH值(3.6～8.0)對Cyr增強CdSe/CdS QDs熒光強度的影響。由圖2可知，當體系pH≤5.0或者≥6.0時，熒光強度變化很??；在pH 5.2～5.6范圍時，Cyr的加入使得CdSe/CdS QDs的熒光強度顯著增強，在pH 5.6時達到最大。因此，后續(xù)實驗選擇pH 5.6的緩沖溶液。

2.5 反應時間的影響

在上述優(yōu)化條件下，于1.0～28 min范圍內每隔1.0 min測定1次溶液體系的熒光強度變化。結果表明，體系的熒光強度變化值在1.0～8.0 min內逐漸增加，8.0 min達到最大，此后隨著時間的增加基本保持不變。因此，選擇最佳反應時間為8.0 min。

2.6 共存物質的影響

圖3 辣椒中CdSe/CdS QDs隨Cyr濃度變化的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence spectra of CdSe/CdS QDs varied with concentration of Cyr in pepperconcentration of Cyr(1-6):20,40,60,80,100,110 nmol/L;pH 5.6

2.7 線性范圍與檢出限

在優(yōu)化條件下，考察了不同蔬菜基質中CdSe/CdS QDs熒光強度與Cyr濃度之間的關系(見表1)。結果表明，不同蔬菜基質中Cyr的濃度(c)均在5.0～120 nmol/L范圍內與CdSe/CdS QDs的熒光強度增強(F/F0)呈線性關系，相關系數(shù)(r)均不小于0.999 1。其中，辣椒中CdSe/CdS QDs隨Cyr濃度變化的熒光光譜圖見圖3。分別以空白基質的3、10倍標準偏差除以基質匹配標準曲線的斜率，得到檢出限(LOD)、定量下限(LOQ)分別為0.8～1.4 nmol/L、2.4～4.6 nmol/L。

表1 所建方法的線性關系、檢出限與定量下限Table 1 Linear relations,detection limits and quantitation limits of the established method

2.8 方法比較

因蔬菜的基質背景熒光峰高于600 nm，本實驗觀察到蔬菜基質對CdSe/CdS QDs的熒光光譜幾乎無影響(p>0.05)。相比于Cyr的其他檢測方法，本方法通過熒光探針的熒光增強方式對Cyr進行選擇性識別，具有線性范圍寬、檢出限低的優(yōu)勢(見表2)。

表2 本方法與Cyr常用檢測方法的比較Table 2 Comparison of common methods with this method for determination of Cyr

*obtained by conversion for convenient comparison

2.9 回收率實驗及實際樣品的測定

為評價方法的準確度和精密度，向辣椒、豇豆、苦瓜、黃瓜和圣女果空白提取液中加入一定量的Cyr標準溶液，按本方法進行4、40、100 μg/kg 3個濃度水平的加標回收實驗。結果如表3所示，Cyr的回收率為82.5%～108%，相對標準偏差(RSD)不大于6.9%，表明該方法具有較好的準確度和精密度。

采用本方法對?？谑协偵絽^(qū)東門市場銷售的蔬菜及澄邁縣永靈村種植地的蔬菜各15個樣品進行了檢測，市售的5種蔬菜中均未檢出Cyr，但在種植地采集的豇豆、辣椒中檢出Cyr，其殘留量分別為0.096～0.105、0.231～0.470 mg/kg，其中辣椒中殘留量較高，但均未超過GB 2763-2016[5]規(guī)定的MRL值。

表3 所建方法的回收率與相對標準偏差(n=3)Table 3 Recoveries and relative standard deviations of the established method(n=3)

3 結 論

本文以TGA作為穩(wěn)定劑制備CdSe/CdS QDs，基于Cyr可增強CdSe/CdS QDs熒光信號的特性，建立了一種測定蔬菜中Cyr含量的熒光探針法。結果表明，Cyr的檢出限為0.8～1.4 nmol/L，定量下限為2.4～4.6 nmol/L，回收率為82.5%～108%，RSD不大于6.9%。該方法靈敏度高、操作簡單、選擇性好，能夠用于實際蔬菜樣品中Cyr的檢測。