胃癌組織COX-2、VEGF、FGF2的表達(dá)及其與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性關(guān)系的研究*

應(yīng)曉媚,劉秀靜

(1.浙江省溫州市中醫(yī)院病理科 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江溫州 325000)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，位于我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率的首位，其主要發(fā)病年齡為50歲及以上，男女比例為2∶1，具有明顯的地域差別[1-3]。由于早期胃癌診斷缺乏有效的特異性臨床生物學(xué)指標(biāo)，且大部分早期胃癌患者無(wú)明顯臨床癥狀，所以臨床上發(fā)現(xiàn)胃癌多已屬中、晚期。有研究表明，胃癌的發(fā)生通常受到遺傳、環(huán)境等多種因素影響。隨著現(xiàn)代醫(yī)療水平的不斷提高，逐漸有研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織通常會(huì)伴隨環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)表達(dá)升高，且多數(shù)學(xué)者研究證實(shí)COX-2選擇性抑制劑具有良好的抗腫瘤治療效果[4-7]。腫瘤的發(fā)生基礎(chǔ)為新生血管是目前臨床醫(yī)師廣泛接受的理論，人體腫瘤細(xì)胞通過(guò)刺激炎性細(xì)胞后釋放血管新生相關(guān)因子，故血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種具有高度特異性的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的因子[8-10]。大量臨床研究表明，部分腫瘤患者血清成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)水平明顯高于身體健康者，因此腫瘤患者的血清FGF2水平可作為臨床?？漆t(yī)師進(jìn)行腫瘤診斷及預(yù)后評(píng)估的潛在可靠指標(biāo)[11-14]。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是一種遺傳性改變，現(xiàn)通常將微衛(wèi)星不穩(wěn)定性陽(yáng)性的胃癌劃分為高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性[11，15-16]。既往對(duì)于胃癌COX-2、VEGF、FGF2的表達(dá)水平及胃癌中微衛(wèi)星不穩(wěn)定研究較多，但研究COX-2、VEGF、FGF2與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性關(guān)系的相關(guān)性研究較少，故本研究選取確診為胃癌的67例患者的臨床資料進(jìn)行回顧性研究，分析胃癌中COX-2、VEGF、FGF2的表達(dá)及其與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取溫州市中醫(yī)院2014年1月至2018年6月確診為胃癌的67例患者作為研究對(duì)象，其中男44例，女23例，年齡38～75歲，平均(58.12±3.59)歲，胃腸外科手術(shù)切除的胃癌及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本各67例用于研究胃癌中COX-2、VEGF、FGF2的表達(dá)及其與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的關(guān)系，標(biāo)本切除后立即凍存，每個(gè)標(biāo)本一部分用于DNA抽提，剩余部分由10%甲醛將其固定后石蠟包埋，切片由蘇木素-伊紅染色，所有標(biāo)本均由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師做出病理診斷，排除具有腫瘤家族史及既往接受過(guò)放療和化療的患者。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)COX-2、VEGF、FGF2表達(dá) 石蠟包埋標(biāo)本層厚4 μm進(jìn)行連續(xù)切片后常規(guī)脫蠟，切片放置于檸檬酸緩沖液中進(jìn)行微波加熱修復(fù)抗原，其一抗為濃度為1∶200的山羊抗人COX-2多克隆抗體，濃度為1∶200的山羊抗人VEGF多克隆抗體，濃度為1∶200的山羊抗人FGF2多克隆抗體，過(guò)夜孵育后進(jìn)行生物素化二抗，其細(xì)胞核用蘇木素復(fù)染中性樹(shù)脂進(jìn)行封片；以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒或棕黃色團(tuán)塊為陽(yáng)性細(xì)胞，COX-2高表達(dá)信號(hào)位于細(xì)胞質(zhì)中，以主要顯色部位為判斷標(biāo)準(zhǔn)，低表達(dá)為COX-2、VEGF、FGF2基本不著色、著色細(xì)胞低于5%或著色細(xì)胞占整張切片5%～25%，高表達(dá)為著色細(xì)胞范圍占整張切片超過(guò)25%。

1.2.2PCR檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性 應(yīng)用DNA提取試劑盒提取癌組織及癌旁正常組織基因組DNA，紫外分光光度法定量。DNA抽提具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，研究對(duì)象的腫瘤組織基因組與正常組織基因組DNA經(jīng)電泳后確定提取成功，選取5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)：BAT-26、BAT-40、D2S123、D17S250、D5S346,采用同一條件進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL，其模板為200 ng，引物各15 pmol，其中dNTPs 0.5 μL,RedTaq DNA聚合酶 1.5 μL。預(yù)變性94 ℃ 2.5 min,循環(huán)參數(shù)為94 ℃ 45 s、55 ℃ 60 s、72 ℃ 90 s,35個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙錠染色后凝膠成像照相保存，將同一患者的腫瘤組織與正常組織標(biāo)本所顯示的條帶進(jìn)行比較。判定標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤組織出現(xiàn)DNA條帶而正常組織未出現(xiàn)條帶則判斷為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性陽(yáng)性，陽(yáng)性標(biāo)本重復(fù)1次，患者出現(xiàn)2個(gè)或2個(gè)以上微衛(wèi)星位點(diǎn)為高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，出現(xiàn)1個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)為低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，無(wú)微衛(wèi)星位點(diǎn)出現(xiàn)為微衛(wèi)星穩(wěn)定性，微衛(wèi)星位點(diǎn)越多，則說(shuō)明腫瘤發(fā)生途徑與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性越相關(guān)。其特異性引物合成序列見(jiàn)表1。

表1 微衛(wèi)星引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSSP22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1COX-2表達(dá)與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的關(guān)系 67例胃癌標(biāo)本中，微衛(wèi)星穩(wěn)定性38例(56.72%)，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性29例(43.28%)，高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性COX-2低表達(dá)率明顯高于COX-2高表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性COX-2低表達(dá)率明顯高于微衛(wèi)星穩(wěn)定性COX-2低表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。比較高、低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性及微衛(wèi)星穩(wěn)定性COX-2表達(dá)率的構(gòu)成，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 COX-2表達(dá)與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的關(guān)系

a：P<0.05，與同狀態(tài)COX-2高表達(dá)比較；b：P<0.05，與微衛(wèi)星穩(wěn)定性COX-2低表達(dá)比較

2.2VEGF表達(dá)與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的關(guān)系 67例胃癌標(biāo)本中，高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性VEGF高表達(dá)率明顯低于微衛(wèi)星穩(wěn)定性及低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性VEGF高表達(dá)率明顯低于同狀態(tài)VEGF低表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。比較高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性及微衛(wèi)星穩(wěn)定性VEGF表達(dá)率的構(gòu)成，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 VEGF表達(dá)與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的關(guān)系

a：P<0.05，與高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性VEGF高表達(dá)比較；b：P<0.05，與同狀態(tài)VEGF高表達(dá)比較

2.3FGF2表達(dá)與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的關(guān)系 67例胃癌標(biāo)本中，高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性FGF2高表達(dá)率明顯高于微衛(wèi)星穩(wěn)定性及低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性FGF2高表達(dá)率明顯高于同狀態(tài)FGF2低表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。比較高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性及微衛(wèi)星穩(wěn)定性FGF2表達(dá)率的構(gòu)成，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

2.4微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)PCR檢測(cè)結(jié)果 BAT-26、BAT-40、D2S123、D5S346、D17S250的微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)電泳圖，見(jiàn)圖1。

表4 FGF2表達(dá)與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的關(guān)系

a：P<0.05，與同狀態(tài)FGF2高表達(dá)比較;b:P<0.05，與高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性FGF2高表達(dá)比較

N：癌旁正常組織；T：胃癌組織

圖1 5個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)PCR結(jié)果

3 討論

微衛(wèi)星是基因組中的核苷酸簡(jiǎn)單重復(fù)序列，通常為堿基重復(fù)，可用于遺傳標(biāo)記、遺傳連鎖圖的構(gòu)建及基因的定位，其微衛(wèi)星不穩(wěn)定性則是因復(fù)制錯(cuò)誤引起的簡(jiǎn)單重復(fù)序列的變化，進(jìn)而引起腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移[17-19]。在目前的醫(yī)療研究水平下，學(xué)界認(rèn)為人類大多數(shù)疾病發(fā)生的主要原因是人體遺傳物質(zhì)的突變。

胃癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性在既往研究中的檢出率可達(dá)34%，說(shuō)明微衛(wèi)星不穩(wěn)定性能夠作為胃癌發(fā)展過(guò)程中的診斷指標(biāo)之一。本研究中高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性COX-2低表達(dá)率明顯高于COX-2高表達(dá)率，高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性COX-2低表達(dá)率明顯高于微衛(wèi)星穩(wěn)定性COX-2低表達(dá)率。COX-2是在患者體內(nèi)細(xì)胞受到刺激時(shí)迅速合成的限速酶，主要調(diào)控細(xì)胞增殖與抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)患者體內(nèi)血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移。有研究表明，COX-2在胃癌、乳腺癌及卵巢癌等腫瘤組織中表達(dá)水平明顯降低，本研究結(jié)果表明微衛(wèi)星不穩(wěn)定性途徑發(fā)生的腫瘤通常會(huì)伴隨COX-2的低表達(dá)，與既往研究結(jié)果一致。

VEGF作為一種能夠增強(qiáng)微血管滲透性浸潤(rùn)的強(qiáng)效內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂元，與腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系。VEGF作為腫瘤血管新生最主要的刺激因子之一，能夠解釋本研究中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性胃癌存在的侵襲性及轉(zhuǎn)移性，也有部分原因可能是依賴于腫瘤活躍的微血管滲透性。本研究中胃癌VEGF高表達(dá)，占55.22%(37/67)，67例腫瘤標(biāo)本中，高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性VEGF高表達(dá)率明顯低于微衛(wèi)星穩(wěn)定性及低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性VEGF高表達(dá)率明顯低于同狀態(tài)VEGF低表達(dá)率，本研究在一定程度上能夠說(shuō)明不同新生血管形成的途徑會(huì)造成患者VEGF的表達(dá)不同，預(yù)后較好可能與VEGF低表達(dá)相關(guān)。

FGF2存在于人體多個(gè)器官組織和細(xì)胞中，F(xiàn)GF2在惡性腫瘤組織中的表達(dá)會(huì)明顯升高，與本研究基本一致。本研究胃癌FGF2高表達(dá)45例，占67.16%；67例腫瘤標(biāo)本中，高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性FGF2高表達(dá)率明顯高于微衛(wèi)星穩(wěn)定性及低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性FGF2高表達(dá)率明顯高于同狀態(tài)FGF2低表達(dá)率，F(xiàn)GF2與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合后會(huì)導(dǎo)致患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞分裂與增殖，促進(jìn)腫瘤組織新生血管的形成，導(dǎo)致患者腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。且既往研究表明，乳腺癌、肺癌患者血清FGF2表達(dá)會(huì)明顯高于健康人，進(jìn)而證實(shí)了血清FGF2與腫瘤的相關(guān)性。

綜上所述，胃癌發(fā)生過(guò)程中可能存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)，且可能伴隨COX-2表達(dá)降低，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性胃癌存在不同的新生血管形成的途徑，其VEGF表達(dá)較低，F(xiàn)GF2表達(dá)偏高。