反芻動物纖維酶制劑作用機理及其應(yīng)用效果

閆佰鵬，李發(fā)弟,2，李 飛

（1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 / 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室 /蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2.甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實驗室，甘肅 民勤 733300）

酶主要是枯草芽孢桿菌屬(Bacillus subtilis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)等細菌微生物及米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉 (Trichoderma reesei)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等真菌微生物分泌產(chǎn)生，是一種具有催化活性的生物催化劑[1-3]，具有催化效率高、高選擇性、綠色無毒害等特性，已被廣泛使用于食品生產(chǎn)、醫(yī)藥加工、飼料配制等行業(yè)[4]，為全球可持續(xù)發(fā)展作出巨大貢獻。如何生產(chǎn)高質(zhì)量肉、蛋及奶等畜產(chǎn)品是現(xiàn)階段畜牧領(lǐng)域亟待解決的重要問題，而飼糧是生產(chǎn)高質(zhì)量、高標準畜產(chǎn)品的關(guān)鍵因素。粗飼料是反芻動物的能量來源之一，在飼糧中的比重與飼養(yǎng)成本、瘤胃健康、生長性能等息息相關(guān)，盡管反芻動物擁有強大的瘤胃系統(tǒng)，但消化纖維能力有限，因而限制了粗飼料的充分利用[1]?；陲曫B(yǎng)成本降低、安全可行及效益增加等優(yōu)點使得酶制劑成為反芻動物營養(yǎng)研究的熱點科學(xué)問題之一[5]。大量學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)飼糧添加酶制劑可顯著提高反芻動物生產(chǎn)性能、養(yǎng)分消化率(P＜0.05)以及改變瘤胃微生物區(qū)系，進而降低飼養(yǎng)成本[6-7]，但不同研究間存在一定差異[8]，主要是由于酶制劑的利用受飼糧類型、飼養(yǎng)管理、環(huán)境因素及自身活力等諸多因素的影響導(dǎo)致動物生產(chǎn)效果存在較大差異，因此有必要系統(tǒng)、全面對酶制劑的作用機制、生化特性及影響因素深入了解與研究，旨在為相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 飼用酶制劑的主要作用機理

飼糧碳水化合物主要是由非纖維性碳水化合物和纖維性碳水化合物二大類組成。非纖維性碳水化合物主要包括有機酸、可溶性糖、淀粉、果膠等組成，據(jù)報道，除淀粉外其余部分在瘤胃中幾乎被完全降解，而淀粉的降解率可高達60%～100%[9]，限制反芻動物消化利用飼糧的主要因素為機體對纖維性碳水化合物的消化率。因此，如何提高機體對纖維性碳水化合物的消化利用是反芻動物高效生產(chǎn)的科學(xué)瓶頸。

粗飼料的主要成分纖維素與半纖維素是構(gòu)成反芻動物飼糧不可或缺的纖維性碳水化合物，其在飼糧中比例與動物生產(chǎn)性能、瘤胃健康、飼養(yǎng)成本緊密相關(guān)[10]。研究表明植物細胞的“天然屏障”細胞壁使得反芻動物采食植物源性飼料在體內(nèi)的消化利用率較低[11]。細胞壁由多層復(fù)合結(jié)構(gòu)網(wǎng)狀連接形成，主要是由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素及結(jié)構(gòu)蛋白組成[12]，其纖維素是多個β-D-葡萄糖殘基連接形成的高分子化合物[13]；半纖維素是由多種糖基、乙酰基等構(gòu)成的具有分支的高聚糖，在結(jié)晶纖維素外表面交織形成復(fù)雜的細胞網(wǎng)絡(luò)干擾水解過程，水解產(chǎn)物主要為五碳糖和六碳糖[14-15]；木質(zhì)素是由苯丙烷單元(C6H3)連接形成的復(fù)雜的高分子聚合物，水解效率極其低下，很難被反芻動物消化利用。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，酶制劑以無毒害、無副作用被廣泛用作于畜禽飼糧添加劑[16-17]。酶制劑在畜禽體內(nèi)主要通過降解細胞壁，使纖維素、半纖維素等結(jié)構(gòu)多糖水解為可溶性多糖，被機體消化吸收[18]。

纖維素的降解主要由包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶及一些輔助酶在內(nèi)的纖維素酶協(xié)同進行[19]。通常內(nèi)切葡聚糖酶隨機水解β-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)生大量纖維素短鏈分子；外切葡聚糖酶主要作用于纖維素分子鏈的還原端或非還原端水解β-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)生纖維二糖；β-葡糖苷酶主要作用于纖維素分子鏈的非還原端以纖維寡糖和纖維二糖為水解底物，產(chǎn)生葡萄糖[20]。半纖維素具有復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此降解過程需要多種特定酶協(xié)同完成。根據(jù)其降解部位的不同，半纖維素酶主要有主鏈降解酶和側(cè)鏈降解酶二大類：主鏈降解酶主要有內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶、內(nèi)切-β-1,4-甘露聚糖酶與β-1,4-甘露糖苷酶等；側(cè)鏈降解酶主要有L-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶等[19]。同樣，木質(zhì)素的降解也需要許多酶的參與，主要有木質(zhì)素過氧化物酶、多功能過氧化物酶、漆酶及一些輔助酶共同參與降解過程[21]。

瘤胃是反芻動物特有的消化系統(tǒng)，其中棲居數(shù)量龐大的細菌、纖毛蟲、真菌等微生物，而纖維的消化利用正是通過微生物所分泌的酶進行降解，為機體供能[22]。由于纖維性碳水化合物及木質(zhì)素形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與機體內(nèi)源酶分泌有限致使水解效率低下，攝入纖維在機體未能充分消化利用[9]，隨代謝產(chǎn)物排出機體。自20世紀80年代飼料添加劑工藝的興起，以纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶為主的外源酶被單一或混合應(yīng)用于反芻動物飼糧中[23]，以此增加機體對纖維性碳水化合物的消化利用，此外果膠酶也可以降解纖維素。飼用酶制劑主要是由真菌和細菌等微生物分泌所產(chǎn)生[24]，主要通過彌補內(nèi)源酶分泌不足，將難于消化的纖維素等結(jié)構(gòu)多糖降解為可消化吸收的可溶性糖，同時降低非淀粉多糖在腸道的黏性及消除植酸、α-半乳糖苷等營養(yǎng)物質(zhì)的抗營養(yǎng)作用，進而提高動物的生長性能、養(yǎng)分消化率，改善瘤胃內(nèi)環(huán)境，有利于動物機體健康(表1)[25]。

2 酶制劑在反芻動物營養(yǎng)的研究

2.1 酶制劑對生長性能的影響

大量學(xué)者結(jié)合體內(nèi)、體外和原位降解等方法研究表明，酶制劑的添加顯著提高飼料利用率和動物生長性能(P＜0.05)[34-35]，但受添加方式與劑量、酶活力、飼糧結(jié)構(gòu)與營養(yǎng)水平等大量因素的干擾，酶制劑在動物機體生長性能的作用效果不盡相同。Romero等[26]研究發(fā)現(xiàn)荷斯坦奶牛飼喂添加木聚糖酶與纖維素酶處理的全混合日糧(total mixed ration, TMR)，木聚糖酶處理組顯著增加奶牛干物質(zhì)采食量(dry matter intake, DMI)、有機物攝入量(organic matter intake, OMI)、粗蛋白攝入量(crude protein intake,CPI)(P＜0.05)及提高泌乳早期的產(chǎn)奶量，且對于乳脂及脂肪校正乳(fat corrected milk, FCM)產(chǎn)量有增加的趨勢 (P＜0.10)；馮文曉[36]以杜泊×小尾寒羊雜交F1代公羔為研究對象，分別在水稻秸稈與小麥秸稈飼糧中添加復(fù)合酶制劑，研究表明酶處理組均可提高肉羊平均日增重(average daily gain,ADG)、飼料轉(zhuǎn)化效率(feed conversion ration，F(xiàn)CR)，顯著提高水稻秸稈處理組DMI(P＜0.05)。以上研究表明，飼糧中植物細胞壁可被酶制劑水解，釋放出大量的水溶性碳水化合物及酚類化合物，這些小分子可溶性糖可以被機體消化吸收利用。與之類似，Togtokhbayar等[27]研究發(fā)現(xiàn)給12月齡蒙古公羔(21.6 ± 0.48 kg)飼喂添加纖維素酶與木聚糖酶的飼糧后，纖維素酶對肉羊ADG、FCR及凈收入都顯著增加(P＜0.05)。但也有研究與上述結(jié)果不同，Peters等[8]以經(jīng)產(chǎn)荷斯坦奶牛為研究對象，結(jié)果表明酶制劑處理組(6.2 mL·kg-1TMR)對奶牛DMI、OMI和泌乳性能都無顯著影響(P＞0.05)。Rodriguez等[37]以20月齡公羔為研究對象，在飼糧中添加不同水平纖維酶制劑(0和2 g·kg-1TMR)，結(jié)果表明纖維酶制劑處理組同樣對肉羊采食量、瘤胃發(fā)酵參數(shù)及生長性能無顯著影響(P＞0.05)。

綜上所述，酶制劑的添加可增加機體消化酶活性，同時可直接作用于日糧中難于消化的纖維素等結(jié)構(gòu)多糖，使其降解為可消化吸收的可溶性糖被機體消化吸收，進而提高動物生長性能。但不同研究間酶制劑添加方式與劑量、飼糧結(jié)構(gòu)、飼養(yǎng)管理等因素的不同，在生產(chǎn)實踐中應(yīng)用效果存在較大變異，因此合理、科學(xué)地利用酶制劑、調(diào)整飼糧配方對酶制劑在反芻動物生產(chǎn)實踐具有重要的科學(xué)指導(dǎo)意義。

2.2 酶制劑對養(yǎng)分消化率的影響

植物纖維以侵蝕的方式在反芻動物瘤胃中被水解，而瘤胃微生物定植與穿透能力有限，導(dǎo)致瘤胃微生物分泌的水解酶只能黏附在食糜表面，進而限制纖維降解[38]。Avellaneda等[39]以35和90 d刈割鮮草為日糧來源，每只每天添加0和3 g的酶制劑飼喂薩福克羊，研究發(fā)現(xiàn)與0 g組相比，3 g處理組前胃消化系統(tǒng)消化率顯著提高(P＜0.05)，但日糧中OM、DM、NDF與ADF的全消化道消化率無顯著影響(P＞0.05)；趙連生等[28]同樣研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛基礎(chǔ)日糧中添加0.10%、0.15%和0.20%復(fù)合酶制劑，持續(xù)飼喂56 d，研究表明日糧中添加復(fù)合酶制劑可顯著提高奶牛對日糧DM與NDF的消化率(P＜0.05)。與之相似，Rajamma等[40]利用原位降解方法，在不同精粗比的飼糧中添加外源纖維酶制劑，研究表明與精粗比(70∶30)飼糧相比，在精粗比(60∶40)飼糧中添加外源纖維酶制劑能夠顯著提高飼糧DM、CP、NDF及ADF的降解率(P＜0.05)。以上研究結(jié)果表明，酶制劑的添加可提高日糧營養(yǎng)成分的消化率，其可能是由于改變了瘤胃微生物區(qū)系，選擇性提高相應(yīng)微生物定植與黏附作用，與內(nèi)源酶協(xié)同作用于纖維素、半纖維素，進而增加飼糧中DM、CP、NDF及ADF的降解率。但也有研究表明，在精粗比為(50∶50)飼糧中每只每天分別添加0、8、16和24 g酶制劑于經(jīng)產(chǎn)荷斯坦泌乳奶牛飼糧中，與0 g組相比，酶制劑處理組DM、CP、NDF及EE的消化率均無影響(P＞0.05)[33]，其主要原因在適宜條件下(最適pH、溫度等)酶制劑能夠作用于纖維素、半纖維素的分子鍵將纖維性碳水化合物水解為可溶性單糖，但機體內(nèi)環(huán)境與酶理想環(huán)境存在差異，因此合理選擇酶種類，以及保證酶在機體內(nèi)的活力才能有利于動物生產(chǎn)，增加飼料利用率。此外，酶制劑在機體內(nèi)的作用效果還受到酶的添加方式與劑量[16]、動物生理階段、飼糧精粗比及飼糧類型(TMR、顆粒料、青貯料等)等因素的影響。目前針對不同動物、不同生理階段所需酶制劑種類、添加劑量與方式的研究較少，尋找最佳的作用效果仍是酶制劑在反芻動物營養(yǎng)研究的熱點之一。

表1 飼糧添加酶制劑對反芻動物的影響Table 1 Effect of feeding enzyme preparation on ruminants

2.3 酶制劑對瘤胃發(fā)酵參數(shù)及微生物區(qū)系的影響

酶制劑通過酶－底物作用軸在機體內(nèi)發(fā)揮作用，進而影響瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)、消化酶活性及改變瘤胃發(fā)酵模式[41]。Arriola等[42]以泌乳期荷斯坦奶牛為研究對象，在飼糧中添加酶制劑(3.4 g·kg-1TMR)研究發(fā)現(xiàn)，酶制劑組TVFA濃度顯著高于對照組 (125.7 vs.114.5 mmol·L-1,P＜0.05)；Estrada 等[43]同樣發(fā)現(xiàn)肉羊飼糧中添加酶制劑可顯著增加TVFA的濃度 (54.4 vs.52.8 vs.40.2 mmol·L-1,P＜0.05)。綜上表明，酶制劑的添加可以顯著增加TVFA的含量，主要原因是酶制劑有利于食入碳源轉(zhuǎn)化為VFA及參與微生物蛋白合成的過程，進而導(dǎo)致TVFA濃度增加，同時提高了瘤胃微生物數(shù)量。國春艷[38]利用PCR-DGGE技術(shù)對后備牛飼喂無酶處理TMR與酶處理TMR，結(jié)果表明酶處理組瘤胃微生物DGGE圖譜條帶數(shù)量增加，進一步通過序列分析表明酶制劑增加了瘤胃中普雷沃氏菌(Prevotella brevis)和黃色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)的數(shù)量(P＜0.05)；Yusuf等[44]以16只母羊為研究對象，在飼糧中分別添加0、0.2、0.4和0.6 g·kg-1外源纖維酶制劑，持續(xù)飼喂56 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶制劑組瘤胃中總細菌數(shù)目和真菌數(shù)目顯著高于對照組(P＜0.05)；與之類似，李朝云[45]在不同精粗比飼糧(20:80、50∶50、80∶20)條件下添加纖維素酶與半纖維素酶，結(jié)果表明在精粗比為(20∶80)的飼糧添加下，纖維素酶的添加顯著增加產(chǎn)琥珀絲狀桿菌(Fibrobacter succinogenes)和甲烷菌(Methanogens)的數(shù)量(P＜0.05)；半纖維素酶的添加顯著降低了原蟲數(shù)量(P＜0.05)，對總菌數(shù)量、產(chǎn)琥珀絲狀桿菌等無影響(P＞0.05)；瘤胃微生物數(shù)量會受到飼糧結(jié)構(gòu)、生理階段、動物品種及環(huán)境因素等諸多自身與外界的影響，但飼糧是影響微生物的主要因素。酶制劑的添加有可能提高了纖維分解菌與淀粉分解菌數(shù)量，同時也有研究指出對產(chǎn)琥珀絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)屬有影響，由于上述菌群的改變導(dǎo)致瘤胃微生物數(shù)量發(fā)生改變，而這一改變與瘤胃發(fā)酵息息相關(guān)[46]。綜上，飼糧中添加酶制劑可以改變瘤胃發(fā)酵模式及瘤胃微生物區(qū)系，但也有研究報道發(fā)現(xiàn)不會影響TVFA及單個VFA的濃度及瘤胃微生物區(qū)系，因此未來有必要從微生物基因組角度深入研究與探索。

3 酶制劑對反芻動物作用效果的主要因素

3.1 酶活力與添加劑量

飼糧結(jié)構(gòu)不同對消化所需酶活力與劑量也不同，酶活力是保證具有催化作用的前提條件之一，其催化活性主要受pH、溫度、作用底物等因素的影響[47]，而瘤胃pH范圍為6.0～7.0，溫度為39 ℃左右，無論是pH或溫度都具有差異，因此如何保證酶活力在反芻動物生產(chǎn)中至關(guān)重要[48]。同時，酶制劑的添加劑量與動物機體作用效果并非成線性關(guān)系，Azam等[22]在水牛飼糧中每只每天添加0、10、15和20 g外源纖維酶制劑及Silva等[29]在精粗比為(50:50)飼糧中每只每天分別添加0、8、16和24 g酶制劑飼喂荷斯坦泌乳期奶牛，結(jié)果均表明生長性能、養(yǎng)分消化率及瘤胃發(fā)酵參數(shù)等指標并非與酶制劑劑量有顯著線型相關(guān)性(P＞0.05)。綜上所述，確保酶活力及適宜添加水平才能使機體發(fā)揮最大的生產(chǎn)潛力，盲目利用只會增加飼養(yǎng)成本且對飼料利用率無影響，因此，科學(xué)、合理地利用才會對動物生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

3.2 添加方式

目前，外源酶主要以添加到TMR[6]、粗飼料[49]、精料補充料、青貯飼料[50]等最為普遍，不同的添加方式導(dǎo)致動物生產(chǎn)中作用效果也有很大差異[38,48]。Sutton等[51]利用瘤胃灌注、噴灑TMR、噴灑精料補充料等方式，研究發(fā)現(xiàn)不同的添加方式對奶牛養(yǎng)分消化及瘤胃發(fā)酵都存在差異(P＞0.05)。與之相比較，Dean等[52]分別將纖維酶制劑添加到青貯料、精料補充料、TMR及粗飼料中飼喂泌乳期奶牛，結(jié)果表明精料補充料處理組產(chǎn)奶量與瘤胃pH有降低的趨勢，粗飼料處理組TVFA降低，青貯料處理組增加了瘤胃降解速率但TVFA濃度卻降低，TMR處理組乙丙比、β-羥丁酸(B-hydroxybutyric acid，BHBA)及血液尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)都顯著降低(P＜0.05)，卻增加乳脂與乳蛋白含量；結(jié)合以上研究表明，不同的添加方式必然會導(dǎo)致作用效果的差異，合理的添加方式對機體瘤胃健康、生產(chǎn)性能及經(jīng)濟效益息息相關(guān)。目前，普遍一致的觀點認為酶制劑添加到高水分飼糧(青貯、鮮草)作用效果優(yōu)于精料、預(yù)混料補充料等飼糧成分，主要原因在于水是酶促反應(yīng)重要的介質(zhì)，在水解植物細胞壁過程中具有促進作用。

3.3 飼糧結(jié)構(gòu)類型

生長性能、養(yǎng)分消化率及瘤胃發(fā)酵參數(shù)主要受到飼糧結(jié)構(gòu)的影響。研究表明當飼糧能量濃度不足時，添加酶制劑有利于動物發(fā)揮最大的消化潛力[53]。Arriola等[42]通過不同精粗比飼糧(精料補充料：48%和33%)添加酶制劑飼喂泌乳期奶牛，研究發(fā)現(xiàn)低精料添加酶可以彌補與高精料的能量差，因此導(dǎo)致生產(chǎn)性能與高精料飼糧一致。楊永明[54]以內(nèi)蒙古半細毛羯羊為研究對象，在玉米(Zea mays)秸稈型飼糧與精粗比為30∶70飼糧中分別添加外源纖維酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)玉米秸稈型飼糧酶處理組VFA含量顯著提高(P＜0.05)，其作用效果優(yōu)于精粗比為30∶70飼糧。綜上所述，酶制劑添加于粗飼料型飼糧作用效果優(yōu)于高精料飼糧，探索飼糧結(jié)構(gòu)－瘤胃功能－生產(chǎn)性能三者之間的關(guān)系對酶制劑的利用具有重要意義。

4 小結(jié)

酶制劑通過酶－底物作用軸有效水解飼糧中的纖維成分，對畜禽高效生產(chǎn)、機體健康具有重要作用，但受機體自身及外部環(huán)境等諸多因素的影響，造成應(yīng)用效果間存在一定差異。因此，深入探究酶制劑、動物機體與飼糧三者之間的影響因素對酶制劑合理、科學(xué)應(yīng)用具有重要生產(chǎn)意義。