黃芪桂枝五物湯減少鉑蓄積預(yù)防奧沙利鉑慢性外周神經(jīng)毒性機制研究＊

魏國利，顧展丞，李靈常，馬 駿，陳 晨，錢 峻，霍介格＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 南京 210028；2.江蘇省海門中醫(yī)院 海門 226100；3.江蘇省淮安市中醫(yī)院 淮安 223001；4.江蘇省鹽城市中醫(yī)院 鹽城 224002；5.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院/中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 南京 210023）

奧沙利鉑（oxaliplatin，OXA）作為新一代鉑類抗腫瘤藥物，是多種消化系統(tǒng)腫瘤化療的一線推薦用藥。慢性外周神經(jīng)毒性是限制其作用發(fā)揮的最主要原因，常導(dǎo)致藥物劑量的使用不足甚至化療中止，影響療效[1]。奧沙利鉑致慢性外周神經(jīng)毒性（Oxaliplatininduced chronic peripheral neuropathy, OICPN）主要表現(xiàn)為手足末梢麻木、疼痛及感覺異常，符合中醫(yī)“痹癥”范疇[2]。臨床中發(fā)現(xiàn)黃芪桂枝五物湯可以預(yù)防奧沙利鉑慢性外周神經(jīng)毒性[3]。近來研究發(fā)現(xiàn)鉑蓄積在奧沙利鉑慢性外周神經(jīng)毒性（OICPN）的發(fā)病機制中扮演重要角色[4]。本研究通過建立奧沙利鉑慢性神經(jīng)毒性大鼠模型，觀察黃芪桂枝五物湯對鉑蓄積的影響，探討黃芪桂枝五物湯預(yù)防奧沙利鉑慢性外周神經(jīng)毒性可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

健康雄性Wistar 大鼠45只（上海斯萊克實驗動物中心），SPF 級，體重180-220 g。動物飼養(yǎng)于安靜、通風(fēng)和空氣過濾系統(tǒng)的環(huán)境中，保持室溫20-25℃，相對濕度40% -60% ，自由進食和飲水。為保持動物晝夜生物節(jié)律，實驗室每日8：00至20：00開燈，20：00至次日8：00 熄燈。本實驗嚴格按照國際疼痛學(xué)會（IASP）關(guān)于應(yīng)用清醒動物進行疼痛實驗研究綱要的要求實施和完成。

1.1.2 實驗藥物

生黃芪、桂枝、炒白芍、大棗、生姜均由江蘇省中醫(yī)藥研究中藥房提供。黃芪桂枝五物湯（生黃芪18 g、桂枝9 g、炒白芍9 g、大棗9 g、生姜9 g）成人處方生藥量54 g（前期多次實驗結(jié)果表明高劑量中藥組療效最佳，故本實驗中藥組只設(shè)高劑量組，2.48g·mL-1），加入10倍量的水煎煮，后濃縮至各劑量所需的體積，4℃保存?zhèn)溆谩W沙利鉑（艾恒）注射液，50 mg，批號：12071012，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，5% 葡萄糖注射液100 mL：5 g，批號：2012051801，氯化鈉注射液100 mL：0.9，批號：12012091203。

1.1.3 主要實驗儀器和試劑

疼痛觸覺測試套件（Von frey hairs）購自美國Stoelting公司）普通PCR儀和ABI7500型熒光定量PCR儀購自Applied Biosystems，電感耦合等離子體發(fā)射質(zhì)譜儀ICP-MS 2000（江蘇天瑞儀器）,電鏡全波長酶標儀購自Thermo Scientific；尼氏染色液購自Beyotime，RTPCR試劑盒、q-PCR試劑盒購自Thermo Scientific，PCR引物購自Genscript。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥

將45 只健康雄性Wistar 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，稱重，隨機分為空白組、奧沙利鉑模型組、黃芪桂枝五物湯組，每組15 只。黃芪桂枝五物湯組灌胃給藥10 mL·kg-1，每日1 次，空白組、奧沙利鉑模型組予0.9% NaCl溶液灌胃（10 mL·kg-1），每日1次。奧沙利鉑用藥當天，中藥于奧沙利鉑應(yīng)用前1 h給藥。

1.2.2 奧沙利鉑慢性神經(jīng)毒性模型建立

參照Mihara Y 等[6]的造模方法，將奧沙利鉑50 mg溶于25 mL的5% 葡萄糖溶液中，終濃度為4 mg·mL-1，（2 mL·kg-1）現(xiàn)配現(xiàn)用。除空白組第予以腹腔注射5% 葡萄糖注射液2 mL·kg-1外，其余4 組按照4 mg·kg-1，2 mL·kg-1予以腹腔注射奧沙利鉑。一周2 次，共4 周（d1，2，8，9，15，16，22，23）。

1.2.3 指標檢測

（1）體重：第0、7、14、21、28 d測量大鼠體重。

（2）機械性縮足反射閾值：第0、7、14、21、28 d通過Von Frey試驗檢測大鼠機械性縮足反射閾值。檢測方法：將一個塑料盒子（20×15×20 cm）放到一個金屬篩網(wǎng)上，在測試之前先讓大鼠適應(yīng)5 min。選取折力1-15 g Von Frey纖維細絲垂直刺激大鼠后肢足底中間的部分，持續(xù)時間為6 s。測定時首先從折力2.0 g 開始，當該力度的刺激不能引起陽性反應(yīng)時，則給予相鄰大一級力度的刺激；若出現(xiàn)陽性反應(yīng)則給予相鄰小一級力度的刺激。每個折力的Von Frey纖維細絲均連續(xù)測定5次，每次刺激間隔30 s，5次當中有3次或3次以上的陽性反應(yīng)視為有機械痛敏，最大力度為15 g，大于此值時記為15 g。大鼠機械縮足閾值持續(xù)下降表示神經(jīng)毒性的產(chǎn)生。

（3）坐骨神經(jīng)HE染色：造模第28 d，每組選擇3只大鼠，腹腔注射10% 水合氯醛（3 mL·kg-1）麻醉后仰臥固定，注入100 mL PBS，后注入100 mL 4% 的多聚甲醛固定，分離大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)（從上端開始大概取長度為0.5 cm），將坐骨神經(jīng)投入預(yù)先配好的4% 多聚甲醛固定液中使組織固定。后脫水透明石蠟包埋，切白片HE染色液染色后用中性樹膠封片，普通光鏡觀察測量核仁大小。

（4）背根神經(jīng)節(jié)（Dorsal root ganglion,DRG）尼氏染色：造模第28 d，每組選擇3 只大鼠，腹腔注射10% 水合氯醛（3 mL·kg-1）麻醉后仰臥固定，注入100 mL PBS，后注入100 mL 4% 的多聚甲醛固定，分離L4-5 DRG，將DRG 投入預(yù)先配好的4% 多聚甲醛固定液中使組織固定。后脫水透明石蠟包埋，切白片尼氏染色液染色后用中性樹膠封片，普通光鏡觀察測量核仁大小。

（5）背根神經(jīng)節(jié)電鏡：造模第28 d，每組選擇1 只大鼠，麻醉固定，心臟灌注PBS溶液后分離L4-5 DRG，將DRG 切割成0.5-1 mm 的小塊，先后給予2.5% 的戊二醛、1% 鋨酸中固定后包埋、修片，醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛染色，電鏡觀察細胞微細結(jié)構(gòu)病理改變。

圖1 大鼠機體重變化

圖2 大鼠機械性縮足閾值變化

圖3 大鼠坐骨神經(jīng)HE染色（1000 X）

（6）背根神經(jīng)節(jié)鉑蓄積：造模第28 d，每組選擇3只大鼠，麻醉固定，心臟灌注PBS 溶液后分離L4-5 DRG，-80℃保存。檢測時給予硝酸消解，再次稀釋后采用ICP-MS法檢測細胞內(nèi)鉑含量。

（7）qPCR 檢測背根神經(jīng)節(jié)OCT2、ATP7A 基因表達：造模第28 d，每組選擇3只大鼠，麻醉固定，DRG分離同上，-80℃保存。檢測時將標本放入加有1mlTRIZOL的EP管中，在勻漿機上勻漿后加入試劑提取總RNA，1ugRNA 用于cDNA 第一鏈的合成，PCR 引物序列如下：OCT2-F：5'-CAG AGG AGC TGA ACT ACA CCG T-3'，OCT2-R：5'-ACA GTG GGT CCA CAC AGT CA-3'；ATP7A-F：5'-TAG ACG GCA TGC ATT GTA AAT C-3'，ATP7A-R：5'-TGG ATT TTA CAC CTG GCT TCT T-3'；內(nèi) 參GAPDH-F：5'-TGG TCT ACA TGT TCC AGT ATG ACT-3',內(nèi)參GAPDH-R：5'-CCA TTT GAT GTT AGC GGG ATC TC-3'。RT-PCR:

反應(yīng)條件25℃5 min，42℃30 min，85℃5 min，反應(yīng)停止后測cDNA 濃度，稀釋10 倍用。qPCR:反應(yīng)體系：2*SYBR 10 μL ，引物F 1 μL ，引物R 1 μL ，cDNA 2 μL，Water 6 μL，離心進樣檢測計算RQ值。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，多組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01表示具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重變化

與空白組相比，隨著奧沙利鉑的應(yīng)用，模型組大鼠開始出現(xiàn)體重下降，第21 d 出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），第28 d（P< 0.01）。而黃芪桂枝五物湯不能改善奧沙利鉑導(dǎo)致的體重下降（P>0.05）（圖1）。

2.2 各組大鼠不同時間機械性縮足閾值變化

與空白組相比，造模第14 d 模型組大鼠開始出現(xiàn)機械性縮足閾值下降（P<0.05）。第21、28 d模型組機械性縮足閾值下降更為明顯（P<0.01），而黃芪桂枝五物湯高劑量組未出現(xiàn)明顯的機械閾值下降（P>0.05）（圖2）。

2.3 各組大鼠坐骨神經(jīng)病理形態(tài)變化

圖4 大鼠背神經(jīng)節(jié)光鏡油鏡圖片1000X

圖5 大鼠背根神經(jīng)節(jié)電鏡2.5K

圖6 大鼠背根神經(jīng)節(jié)鉑含量

HE染色后光鏡下觀察坐骨神經(jīng)（圖3），與空白組（A）相比，多次腹腔注射奧沙利鉑后，模型組（B：奧沙利鉑）大鼠坐骨神經(jīng)神經(jīng)纖維排列紊亂。黃芪桂枝五物湯組（C：奧沙利鉑+黃芪桂枝五物湯2.48 g·mL-1）神經(jīng)纖維排列輕度紊亂。

2.4 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞核仁大小變化

尼氏染色后光鏡下觀察背根神經(jīng)節(jié)（圖4），與空白組（A）相比，多次腹腔注射奧沙利鉑后，大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞胞質(zhì)淡然，核仁縮?。ê谏^指示），模型組（B：奧沙利鉑）核仁縮小最明顯。黃芪桂枝五物湯組（C：奧沙利鉑+黃芪桂枝五物湯2.48 g·mL-1）核仁大小變化輕。

2.5 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體變化

電鏡下觀察（圖5），與空白組（A）相比，多次腹腔注射奧沙利鉑后大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞的線粒體（紅色箭頭指示）出現(xiàn)腫脹，部分嵴斷裂和空泡形成，模型組（B：奧沙利鉑）線粒體損傷最明顯。黃芪桂枝五物湯組（C：奧沙利鉑+黃芪桂枝五物湯2.48 g·mL-1）線粒體有腫脹但無空泡形成。

2.6 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)鉑含量

ICP-MS 法定量檢測背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)的鉑含量（圖6），與空白組相比，多次腹腔注射奧沙利鉑后大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞內(nèi)鉑含量增加，與慢性外周神經(jīng)毒性的程度呈正相關(guān)，模型組鉑含量顯著高于空白組（P<0.01），中藥組的鉑含量均明顯低于模型組（P<0.05）。

2.7 背根神經(jīng)節(jié)鉑蓄積相關(guān)因子OCT2、ATP7A 基因表達

qPCR 結(jié)果顯示（圖7），與空白組相比，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞OCT2mRNA表達量增加（P<0.05），ATP7AmRNA 表達量無變化（P> 0.05），與模型組相比，黃芪桂枝五物湯組OCT2 mRNA和ATP7AmRNA的表達量均下降（P<0.05）。

3 討論

圖7 大鼠背根神經(jīng)節(jié)OCT2和ATP7A mRNA表達比較

奧沙利鉑是臨床中廣泛應(yīng)用的化療藥物，其與氟尿嘧啶組成的化療方案被國內(nèi)外各大指南一致推薦為結(jié)直腸癌術(shù)后輔助化療的標準方案。外周神經(jīng)毒性限制了其臨床應(yīng)用，奧沙利鉑引起的外周神經(jīng)毒性分為急性和慢性兩種，急性神經(jīng)毒性常發(fā)生在奧沙利鉑用藥后1 周內(nèi)，一般癥狀輕微可自行恢復(fù)[5]；慢性外周神經(jīng)毒性是其劑量限制性毒性，一般在應(yīng)用奧沙利鉑2周期以后逐漸出現(xiàn)，隨著奧沙利鉑累積劑量的增加而加重，4-6周期化療結(jié)束后發(fā)生率高達42.1-69% ，臨床表現(xiàn)為四肢末端的麻木、疼痛可伴有精細運動障礙，部分患者停藥后癥狀仍可持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年嚴重影響了患者的生活質(zhì)量[6-8]。雖然已開展了多種藥物防治奧沙利鉑外周神經(jīng)毒性的臨床研究，如鈣鎂合劑、還原型谷胱甘肽、卡馬西平、文拉法辛、維生素E、B 族維生素等[9]。但是到目前為止沒有任何一種藥物被證實可以有效的防治奧沙利鉑引起的慢性外周神經(jīng)毒性。

研究表明鉑蓄積是奧沙利鉑慢性外周神經(jīng)毒性產(chǎn)生的重要機制，背根神經(jīng)節(jié)（DRG）是奧沙利鉑慢性外周神經(jīng)毒性主要的傷害靶器官，奧沙利鉑進入機體后會優(yōu)先蓄積在背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)[10]。文獻報道，OCT2 和ATP7A 是鉑蓄積的關(guān)鍵因子，鉑類藥物進入機體后，背根神經(jīng)節(jié)細胞通過OCT2 將藥物轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，通過ATP7A將藥物泵出細胞外，二者失衡后導(dǎo)致了鉑蓄積，鉑蓄積會激活氧化應(yīng)激、線粒體損傷等，引起DRG神經(jīng)元細胞損傷，導(dǎo)致DRG 功能異常，產(chǎn)生外周神經(jīng)毒性[11,12]。體外實驗發(fā)現(xiàn)給予奧沙利鉑處理，過表達OCT2 的HEK293 細胞株鉑含量是正常細胞株的28.6倍，體內(nèi)實驗也發(fā)現(xiàn)抑制OCT2 的表達可以減少奧沙利鉑神經(jīng)毒性的發(fā)生[13]。研究同時也發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)腫瘤不表達或極少表達OCT2，體內(nèi)外實驗也證實抑制OCT2 的功能，不影響鉑類藥物的抗腫瘤作用[14,15]。Virginia 等也實驗證實ATP7A 表達增加可以促進奧沙利鉑流出細胞從而減少其對神經(jīng)元DNA 損傷的結(jié)果[16]。

OICPN 主要表現(xiàn)為手足末梢麻木、疼痛及感覺異常伴或不伴有精細運動障礙，屬于祖國醫(yī)學(xué)“痹證”的范疇?！秲?nèi)經(jīng)·痹論》“其不痛不仁者，病久入深，榮衛(wèi)之行澀，經(jīng)絡(luò)時疏，故不痛，皮膚不營，故為不仁”。腫瘤患者本身存在正氣不足，化療藥物屬于有毒傷正之品，應(yīng)用奧沙利鉑后會進一步損傷機體正氣，導(dǎo)致氣血不足，營衛(wèi)虛弱，氣虛則推動無力血行澀滯，血虛則榮養(yǎng)不足，最終四肢末梢經(jīng)絡(luò)閉阻不通，筋脈失養(yǎng)，不通、不榮則出現(xiàn)四肢末梢疼痛、麻木等癥狀。基于此，我們認為OICPN 的中醫(yī)病機為氣血不足，營衛(wèi)虛弱，經(jīng)絡(luò)閉阻。黃芪桂枝五物湯出自張仲景的《金匱要略》，是治療“痹證”的經(jīng)典名方，黃芪桂枝五物湯對OICPN預(yù)防作用已有大量的文獻報道[17,18]。前期我們開展的小樣本隨機對照臨床研究（NCT02590367），結(jié)果顯示黃芪桂枝五物湯可以預(yù)防OICPN 的發(fā)生且不影響奧沙利鉑的抗腫瘤療效[19]。

在本實驗中我們建立了OICPN 動物模型，結(jié)果顯示黃芪桂枝五物湯可以拮抗奧沙利鉑引起的機械性縮足閾值的下降，預(yù)防OICPN 發(fā)生。進一步的實驗結(jié)果也證實黃芪桂枝五物湯可以減少鉑蓄積及鉑蓄積導(dǎo)致的下游細胞損傷如核仁縮小、線粒體腫脹等。qPCR的結(jié)果提示黃芪桂枝五物湯可能是通過下調(diào)OCT2表達、上調(diào)ATP7A表達，減少背根神經(jīng)節(jié)細胞鉑蓄積的。本研究首次從鉑蓄積的角度研究中藥復(fù)方黃芪桂枝五物湯預(yù)防奧沙利鉑慢性外周神經(jīng)毒性發(fā)生的機制，為臨床中的應(yīng)用提供了依據(jù)。但黃芪桂枝五物湯如何調(diào)控OCT2h和ATP7A表達尚不清楚，值得進一步研究。