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    固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法測定土鱉蟲中12 種真菌毒素*

    2019-10-22 03:06:26余詩琪
    關(guān)鍵詞:土鱉蟲黃曲霉限量

    余詩琪,汪 波,呂 盼,聶 晶**

    (1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430065;2.湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院 武漢 430075)

    土鱉蟲(Eupolyphaga Steleophaga)為鱉蠊科昆蟲地鱉Eupolyphaga sinensis或冀地鱉Steleophaga plancyi的雌蟲干燥體[1],有溶血栓、抗凝血、抗腫瘤、促進骨折愈合、調(diào)節(jié)血脂、耐缺氧、抗突變等作用[2],主要用于治療跌打損傷、骨折筋傷、血瘀經(jīng)閉等證[3]。在我國河北、山東、河南、山西、湖北等省均有出產(chǎn)[4]。作為動物類中藥,土鱉蟲在加工、運輸、貯藏過程中易發(fā)霉,沾染真菌[5],其真菌產(chǎn)生的真菌毒素對人體及動物具有毒害作用,關(guān)于動物藥材易污染真菌的問題目前已得到廣泛關(guān)注[6],如羅朝權(quán)等[7]對6 種動物類藥材中黃曲霉毒素進行檢測,發(fā)現(xiàn)土鱉蟲的污染率高達33.3% 。土鱉蟲類動物藥材基質(zhì)復(fù)雜,極可能被各種不同的真菌污染并產(chǎn)生不同類型的真菌毒素,但有關(guān)土鱉蟲中其他種類的真菌毒素檢測的報道較少。真菌毒素是一類天然產(chǎn)生的生物毒素[8,9],目前已發(fā)現(xiàn)包括黃曲霉毒素類、伏馬毒素類、赭曲霉毒素等300 多種真菌毒素[10],大多數(shù)真菌毒素都具有致癌、致畸和致突變的毒性作用[11],其共同毒性主要是致DNA 損傷和細胞毒性,低濃度下即可對人和動物健康造成危害,使肝臟、腎臟和胃腸道發(fā)生病變[12-14],對人類健康造成威脅,《中華人民共和國藥典》(2015版)已收錄了19種中藥材黃曲霉毒素的限度檢查[15],但并未對土鱉蟲中的黃曲霉毒素限量標準有所規(guī)定暫未進行控制。

    截至目前,已有大量的真菌毒素的檢測方法,并從最初的薄層色譜法[16]逐漸發(fā)展到氣相色譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、快速檢測技術(shù)等多種方法[17,18],包括了儀器分析、化學(xué)分析、生物鑒定和免疫分析等方面[11]。這些方法可以分為快速篩選法和確證法兩大類,快速篩選法主要是酶聯(lián)免疫法[19],此法對樣品前處理要求簡單,不需要昂貴的設(shè)備,靈敏度很高,但該法需要的抗體抗原制備過程復(fù)雜,技術(shù)難度高且存在一定的假陽性;確證法主要有氣相色譜法(GC)、液相色譜法(HPLC)及其與質(zhì)譜聯(lián)用檢測法等[20]。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[21]可以同時提供目標化合物的保留時間和分子結(jié)構(gòu)信息,對凈化要求低、靈敏度高、雜質(zhì)影響小、適合多組分同時分析。免疫親和柱凈化法是最常用的凈化方法,但該凈化方法大多數(shù)只能用于某一種或同一類型真菌毒素的凈化。如陳思穎等[22]采用免疫親和柱凈化,UPLC-MS/MS 測定了天麻藥材中黃曲霉毒素的含量。楊麗博等[23]采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜法測定小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。關(guān)于多種真菌毒素的同時檢測,多采用多功能免疫親和柱凈化[24]或HLB 固相萃取柱[25]凈化,免疫親和柱利用抗原抗體特異性可逆結(jié)合的原理,而多功能免疫親和柱只針對幾種類型的真菌毒素進行凈化富集,對于多種真菌毒素的檢測具有局限性。HLB固相萃取柱的保留機理為反相,通過一個“特殊的極性捕獲基團”來增加對極性物質(zhì)的保留提供很好的水浸潤性,可用于不同種類的真菌毒素的凈化處理。

    本文通過HLB 固相萃取柱凈化,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測,建立了土鱉蟲中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1,伏馬毒素B1、B2,赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、T-2 毒素和桔青霉毒素共12種真菌毒素的檢測方法,以期為土鱉蟲藥材中多種真菌毒素的含量測定提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器

    島津LC30A-4500 Q-trap 型液質(zhì)聯(lián)用儀;Milli-Q系列超純水處理系統(tǒng)(美國密理博公司);美國Waters Oasis 公司HLB 固相萃取柱(6 cc,200 mg);Thermo Fisher ST16R型高速冷凍離心機;P-12-瑞士BUCHI平行蒸發(fā)儀;??艫H-30全自動均質(zhì)器。

    1.2 材料

    黃曲霉毒素混合對照品溶液(中國食品藥品檢定研究院,YSRJ-8KLK,黃曲霉毒素G2(AFG2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素B1(AFB1)濃度分別為0.38 μg·mL?1、1.06 μg·mL?1、0.43 μg·mL?1、1.02 μg·mL?1),伏馬毒素B1(FB1)、(Pribolab,批 號:1700110,50 μg·mL?1)、伏 馬 毒 素B2(FB2)(Pribolab,批號:1601116,50 μg·mL?1),桔青霉毒素(Citrinin)(Pribolab,批號:1600926,101 μg·mL?1),T-2毒素(T-2)(Pribolab,批號:1601125,100 μg·mL?1),黃曲霉毒素M1(AFM1)(Pribolab,批號:1700201,10 μg·mL?1),嘔吐毒素(DON)(Pribolab,批號:1601020,100 μg·mL?1),玉米赤霉烯酮(ZEN)(Pribolab,批號:1601205,25 μg·mL?1),赭曲霉毒素A(OTA)(Pribolab,批號:1601006,10 μg·mL?1)。甲醇、乙腈為色譜純;醋酸銨為質(zhì)譜級。

    1.3 色譜、質(zhì)譜條件

    色譜柱:Phenomenex Kinetex XB-C18(1.7 μm,100 mm,2.1 mm);流動相5 mmol·L-1醋酸銨(pH=3.0)(A)-乙腈(B),梯度洗脫[10% B(0-5 min),20% B(5-6 min),45% B(6-30 min),10% B(30-35 min)]。流速為0.2 mL·min-1,柱溫為30℃。進樣量為2 μL。色譜圖(圖1、圖2)。

    黃曲霉毒素G1、G2、B1、B2、M1,桔青霉毒素,伏馬毒素B1、B2,T-2毒素采用ESI+測定;嘔吐毒素,赭曲霉毒素A,玉米赤霉烯酮采用ESI-測定。以三重四級桿質(zhì)譜儀作為檢測器,電化學(xué)噴霧離子源(ESI)。采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)采集質(zhì)譜數(shù)據(jù),各化合物質(zhì)譜參數(shù)(表1)。

    1.4 混合對照品溶液的配制

    分別精密吸取上述對照品適量,加甲醇配置成黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、桔青霉毒素、T-2毒素、伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A 以及嘔吐毒素濃度依次為為51 ng·mL?1、21.5 ng·mL?1、53 ng·mL?1、19 ng·mL?1、100 ng·mL?1、1000 ng·mL?1、300 ng·mL?1、100 ng·mL?1、100 ng·mL?1、150 ng·mL?1、100 ng·mL?1以及2000 ng·mL?1。

    1.5 供試品溶液的制備

    1.5.1 提取

    稱取粉碎均質(zhì)土鱉蟲樣品5.00 g 于50 mL 聚四氟乙烯離心管中,加入加入80% 乙腈溶液40 mL,勻漿提取1 min,離心20 min(離心速度8000 r·min-1),取上層清液于另一個聚四氟乙烯離心管中;將上清液減壓濃縮至5-6 mL 并用80% 乙腈溶液轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中,加純水至刻度;取1 mL 于5 mL 容量瓶中,純水定容,待凈化。

    1.5.2 凈化

    圖1 正離子模式總離子流圖

    圖2 負離子模式總離子流圖

    預(yù)先用3 mL 甲醇和3 mL 純水活化柱子。精密吸取上述溶液4 mL,緩慢通過HLB 固相萃取柱凈化,流速控制在2-3 mL·min-1,直至有適量空氣通過,隨后用5 mL純化水淋洗,再用5 mL甲醇洗脫,收集洗脫液,于平行蒸發(fā)儀上濃縮至近干,精密加入50% 乙腈溶液2 mL,0.22 μm膜過濾后,即得供試品溶液。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 樣品前處理提取溶劑的選擇

    對土鱉蟲樣品提取溶劑的選擇,真菌毒素的提取通常采用極性溶液,主要提取液有乙腈水和甲醇水的不同比例溶液。本實驗考察了80% 甲醇、70% 甲醇和70% 乙腈、80% 乙腈、90% 乙腈溶液的提取液,比較提取效率,發(fā)現(xiàn)在以乙腈作為提取液時,真菌毒素的提取回收率普遍增加,并且隨乙腈濃度的增加回收提取率也得到提高,以80% 乙腈溶液作為提取液能得到較高的回收率,提取效果更好結(jié)果見圖3。因此本實驗采用80% 乙腈水溶液作為提取液。

    2.2 質(zhì)譜條件的選擇

    2.2.1 母離子的選擇

    將黃曲霉毒素混合溶液配制成AFB1、AFB2、AFG1、AFG2濃度分別為25.5 ng·mL?1、10.75 ng·mL?1、26.5 ng·mL?1、9.5 ng·mL?1,嘔吐毒素配制成10010 ng·mL?1的單標,各真菌毒素配制成10 ng·mL?1的單標,根據(jù)各化合物分子的化學(xué)電離性質(zhì),分別選用ESI+和ESI-作為離子化模式,通過針泵連續(xù)進樣標準溶液,在優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)的基礎(chǔ)上,獲得各毒素的母離子信息。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、伏馬毒素B1、B2、桔青霉毒素和T-2毒素在ESI+模式下,可獲得較高的靈敏度;嘔吐毒素、赭曲霉毒素A 和玉米赤霉烯酮在ESI-模式下可以得到較好的響應(yīng)值。

    表2 線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

    2.2.2 子離子的選擇及碰撞電壓的優(yōu)化

    根據(jù)歐盟(2002/657/EC)指令規(guī)定低分辨率質(zhì)譜聯(lián)用檢測應(yīng)在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇2個以上的子離子[26]。在確定各真菌毒素的母離子后,采用子離子掃描,設(shè)定掃描范圍,覆蓋可能的子離子質(zhì)量范圍。隨著碰撞能量的不斷增加,選擇響應(yīng)最強的2-3 個子離子作為候選。根據(jù)找到的離子對,通過MRM掃描模式優(yōu)化并獲得各毒素離子對的最佳DP和CE電壓值。

    2.3 線性關(guān)系與靈敏度考察

    將1.4配置的混合對照品溶液用甲醇稀釋,得到黃曲霉素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素M1、桔青霉毒素、伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、T-2 毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的濃度分別為2.04 ng·mL?1、0.86 ng·mL?1、2.12 ng·mL?1、0.76 ng·mL?1、4 ng·mL?1、40 ng·mL?1、4 ng·mL?1、12 ng·mL?1、80 ng·mL?1、6 ng·mL?1、4 ng·mL?1。以峰面積對相應(yīng)真菌毒素的濃度作圖,結(jié)果表明待測化合物濃度與對應(yīng)峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2>0.99);由于土鱉蟲樣品對測定化合物存在基質(zhì)效應(yīng),實驗中取不含真菌毒素的空白樣品為溶劑,將1.4項配制的混合對照溶液稀釋成系列濃度,進樣檢測,按照10 倍噪音計算檢出濃度(定量限,LOQ),線性關(guān)系考察結(jié)果及檢測限、定量限測定結(jié)果詳見表2。

    2.4 回收率試驗

    取同一批次土鱉蟲樣品粉末約5 g(過二號篩),精密稱定,稱取18 份,6 份為一組,按低、中、高3 濃度水平分別精密加入混合對照品溶液0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL,依次制備供試品溶液并測定含量,計算回收率,結(jié)果(表3)。由表3可以看出,12種真菌毒素的回收率為68.9% -110.2% ,相對標準偏差(RSD)為1.5% -13.33% 。

    2.5 重復(fù)性試驗

    取土鱉蟲樣品粉末5 g(過二號篩),稱取6 份,精密稱定,精密加入加樣回收率用混合對照品溶液1 mL,依法制備供試品溶液,進樣分析,結(jié)果為12種真菌毒素的相對標準偏差(RSD% )為0.58% -7.56% ,表明本實驗重復(fù)性試驗結(jié)果良好(表4)。

    表3 回收率試驗結(jié)果

    表4 重復(fù)性試驗結(jié)果

    表5 樣品測定結(jié)果

    2.6 穩(wěn)定性試驗

    取重復(fù)性試驗項下供試品溶液,一日內(nèi)每隔6 h進樣分析,記錄峰面積,結(jié)果表明,在24 h內(nèi),供試品溶液保持穩(wěn)定。

    2.7 實際樣品分析測定

    對收集到的4 批土鱉蟲樣品進行真菌毒素測試,其中有三批樣品黃曲霉毒素類有檢出,并且超出限量標準,只有一批樣品檢出伏馬毒素B1、B2和T-2。具體測定結(jié)果(表5)。結(jié)果表明,土鱉蟲藥材易被真菌毒素感染,應(yīng)采取有效措施避免污染。

    3 討論

    考慮HLB 柱的凈化原理,溶劑極性太弱,將得不到保留或保留很弱。需要對樣品溶液進行稀釋處理,加大強極性溶劑的比例以增強分析物的富集。本實驗采用80% 乙腈轉(zhuǎn)移定容,加純化水進行稀釋處理后再經(jīng)HLB柱凈化富集。

    液相色譜條件的優(yōu)化,選用了甲醇-5 mmol·L-1乙酸銨、乙腈:甲醇(1∶1)-0.01% 甲酸、甲醇-0.1% 甲酸為流動相,分離效果均不理想,且得到的大多數(shù)真菌毒素離子對的峰型不好。選用乙腈-5 mmol·L-1醋酸銨為流動相,采用合適的梯度洗脫條件,各標準物質(zhì)可以實現(xiàn)較好的分離,但峰型不穩(wěn)定。真菌毒素在酸性條件下較為穩(wěn)定,本實驗采用乙腈-5 mmol·L-1醋酸銨為流動相,考察了5 mmol·L-1的醋酸銨在pH 為2.0、2.5、3.0、3.5 時色譜峰的信號。在pH=3.0 時,色譜峰的峰型更穩(wěn)定,質(zhì)譜信號值最強。

    本實驗采用空白提取液加標法,即通過比較空白樣品提取液中加入標準溶液和相同濃度的標準溶液的響應(yīng)來考察基質(zhì)效應(yīng)。按照以下公式計算其基質(zhì)效應(yīng),土鱉蟲中多數(shù)化合物的SSE% 在90% 以下,表明土鱉蟲樣品有基質(zhì)干擾作用。消除基質(zhì)效應(yīng)可通過采用合適的前處理方法、使用內(nèi)標物或基質(zhì)外標法等方法,但是由于同位素內(nèi)標價格比較昂貴,實驗成本較高,并且所分析的物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)差異較大,很難找到一種或幾種化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)作為內(nèi)標物[27]。實驗中可根據(jù)具體實驗情況來確定是否需要進行空白基質(zhì)標準曲線的制備,本實驗的線性關(guān)系曲線采用空白基質(zhì)標準溶液來制備。

    本文研究發(fā)現(xiàn)土鱉蟲藥材基質(zhì)較為復(fù)雜,易產(chǎn)生的毒素種類有黃曲霉毒素類、伏馬毒素類以及玉米赤霉烯酮等?!吨袊嗣窆埠蛧幍洹罚?015 版)[15]一部規(guī)定了黃曲霉毒素在中藥材中的最高限量標準,即AFB1與AF(B1+B2+G1+G2)不得高于5 μg·kg?1和10 μg·kg?1,但并未制定其他毒素的限量標準。我國目前只規(guī)定了赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮等毒素在食品和飼料中的限量。GB2761-2017《食品中真菌毒素限量》規(guī)定了赭曲霉毒素A 在食品中的限量不得高于5 μg·kg?1,而玉米赤霉烯酮在食品中的限量為不得高于60 μg·kg?1[28]。歐盟規(guī)定嬰幼兒玉米制品中FB(含F(xiàn)B1和FB2)的總量為0.3 mg·kg?1,谷粉及玉米粉中嘔吐毒素的限量為0.75 mg·kg?1玉米種的限量值為4 mg·kg?1;美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration,F(xiàn)DA)規(guī)定玉米種FB1、FB2和FB3總量的最高限量值為2 mg·kg?1,規(guī)定供人類使用的磨粉用小麥中嘔吐毒素的限量為1 mg·kg?1;我國規(guī)定谷物及其制品小麥、大麥、麥片、玉米、玉米制品中嘔吐毒素的限量標準為1 mg·kg?1,有關(guān)文獻建議將中藥中嘔吐毒素的限度規(guī)定為1 mg·kg?1[29,30]。本實驗中有三份土鱉蟲樣品黃曲霉毒素超出限量,其中一份黃曲霉毒素G1 含量高達89.0 μg·kg?1,一份樣品檢出赭曲霉毒素A 含量為8.2 μg·kg?1,一份樣品檢出玉米赤霉烯酮含量高達79.8 μg·kg?1。土鱉蟲藥材的炮制工藝為曬干、沸水泡或文火炒等。經(jīng)炮制后還保留有一定的水分,若在儲存過程中溫度、濕度以及通風(fēng)條件等控制不當(dāng),易生成霉菌產(chǎn)生真菌毒素。因此,應(yīng)進一步改善對土鱉蟲藥材的管理措施,減少污染。

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