活血補(bǔ)腎方對(duì)大鼠退變腰椎間盤(pán)mTOR通路依賴性自噬的影響＊

姚嘯生，王 禹，荊 濤，戚曉楠，楊鶇祥，鄭洪新，謝晚晴

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 沈陽(yáng) 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 沈陽(yáng) 110847）

腰痛（low back pain，LBP）是一種常見(jiàn)的脊柱相關(guān)疾病，全球患病率為9.4%[1]。官方統(tǒng)計(jì)顯示2017 年我國(guó)16-59歲（含不滿60周歲）總?cè)丝跒?.0199億，估算我國(guó)成人患病人數(shù)高達(dá)8479萬(wàn)。其中，工作人群的發(fā)病率是非工作人群的2.5 倍[2]。腰痛也是全球范圍內(nèi)首位致殘的疾病[3]，在我國(guó)，是除頸痛外的第二大致殘疾病，該病導(dǎo)致測(cè)量腰痛疾病負(fù)擔(dān)的指標(biāo)——傷殘損失壽命年從1990年的620萬(wàn)年增長(zhǎng)到2016年的770萬(wàn)年[4]，同時(shí)，也是因病缺勤和生產(chǎn)力損失的主要原因。耗費(fèi)大量醫(yī)療費(fèi)用，給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[5]。

而與腰痛關(guān)系最密切的病因是椎間盤(pán)退變（interverbral disc degeneration,，IDD），約占其病因的40% 。雖然缺少相關(guān)的流行病學(xué)調(diào)查，但隨著我國(guó)人口增長(zhǎng)和老齡化進(jìn)程的加快，這一形勢(shì)將更加嚴(yán)峻。IDD 的治療包括以理療為主的保守治療和以椎間融合為主的手術(shù)治療。這些治療措施僅僅能改善臨床癥狀，目前缺少可以延遲和逆轉(zhuǎn)椎間盤(pán)退變的有效療法。目前，包括基因治療[6,7]、基于干細(xì)胞的組織工程[8,9]、調(diào)控椎間盤(pán)退變的生物因素[10]和microRNA[11,12]等，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc, ECM）修復(fù)與再生防治IDD 的生物療法已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但距離臨床應(yīng)用尚有一段不小的距離[10]。

中醫(yī)將IDD引起的LBP歸于“腰痛”、“痹癥”，認(rèn)為IDD 為本虛標(biāo)實(shí)之證。腎虛為其內(nèi)因，風(fēng)、寒、濕三氣侵襲為其外因，而氣血運(yùn)行不暢，瘀血阻滯則是該病的主要病變機(jī)制，又是引發(fā)腰痛的病因之一。古代醫(yī)家基于此理論創(chuàng)制了很多治療腰痛的經(jīng)方。如：《金匱要略》中腎氣丸、《景岳全書(shū)》中右歸丸及左歸丸，《備急千金要方》的獨(dú)活寄生湯，《醫(yī)林改錯(cuò)》身痛逐瘀湯等。其中，獨(dú)活寄生湯具有補(bǔ)益肝腎，活血補(bǔ)血的功效。獨(dú)活寄生湯及其化裁方在臨床廣泛應(yīng)用于腰椎間盤(pán)退行性疾病的治療中，并取得了顯著的療效[13，14]。近年來(lái)，針對(duì)獨(dú)活寄生湯治療IDD作用機(jī)制的基礎(chǔ)研究也從對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響等[15]深入到對(duì)信號(hào)通路影響[16，17]的研究。

自噬是機(jī)體內(nèi)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一種重要作用機(jī)制，也是影響椎間盤(pán)退變中的重要環(huán)節(jié)[18]，椎間盤(pán)內(nèi)自噬主要受到mTOR信號(hào)通路的調(diào)控[19]。通過(guò)提高自噬水平，達(dá)到延緩椎間盤(pán)退變目的是現(xiàn)階段防治IDD 研究的重要方向之一。本研究通過(guò)觀察獨(dú)活寄生湯的化裁方——活血補(bǔ)腎方對(duì)mTOR信號(hào)通路依賴性自噬的影響，闡明該方延緩腰椎間盤(pán)退變的作用機(jī)制，為其治療IDD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

活血補(bǔ)腎方（獨(dú)活9 g、杜仲6 g、槲寄生6 g、熟地黃6 g、川芎6 g、當(dāng)歸6 g、赤芍6 g、牛膝6 g）由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供。雷帕霉素（批號(hào)：RK17S906）購(gòu)自上海瑞永公司，阿爾新蘭染色液購(gòu)自上海源葉公司，0.1% 核固紅染液購(gòu)自北京索萊寶公司，ripa 強(qiáng)裂解液、丙烯酰胺、Tris-HCL 6.8、Tris-HCL 8.8 均購(gòu)自碧云天公司，蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司，牛血清白蛋白購(gòu)自Biosharp公司，封閉液購(gòu)自Thermo 公司，發(fā)光液購(gòu)自Biorad 公司，4E-BP1、p70S6k、Beclin-1、lc-3b 抗體購(gòu)自CST 公司，ghapdh購(gòu)自Proteintech公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

ME204E 電子天平（Mettler Toledo 公司），YD-6L組織包埋機(jī)、YD-A攤片機(jī)、YD-B烤片機(jī)（益迪公司），RM2245 石蠟切片機(jī)（Leica 公司），GZX-DH 電熱恒溫干燥箱（龍躍公司），CX-41 光學(xué)顯微鏡（Olympus 公司），SmartV350D 成像系統(tǒng)（捷達(dá)公司），Dw-HL388 低溫冰箱（中科美菱公司），OS20-S/OS40-S 攪拌器（Scilogex 公司），ST-16 離心機(jī)（Thermo Scientific 公司），電泳儀及轉(zhuǎn)移槽（Bio-Rad 公司），凝膠成像系統(tǒng)（DNR公司），常規(guī)手術(shù)器械等由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模

2月齡健康SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)內(nèi)容已通過(guò)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批許可。大鼠飼養(yǎng)于20-25℃的清潔環(huán)境中，自由攝食攝水。7 d適應(yīng)性飼養(yǎng)后，通過(guò)隨機(jī)數(shù)值表法將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、雷帕霉素組、活血補(bǔ)腎方組和活血補(bǔ)腎+雷帕霉素聯(lián)合組（聯(lián)合組）5 組，12 只/組，雌雄各半。除對(duì)照組外，其余4 組采用去前肢誘導(dǎo)動(dòng)靜力失衡法復(fù)制腰椎間盤(pán)退變大鼠動(dòng)物模型[20]。

造模方法：大鼠術(shù)前12 h禁食水。7% 水合氯醛溶液0.5 mL/100 g 體重腹腔注射麻醉，麻醉成功后消毒。于雙前肢中段依次剪開(kāi)皮膚、皮下組織，分離筋膜、骨骼肌，暴露及結(jié)扎肱動(dòng)、靜脈。于中上1/3 處剪斷肱骨，離斷前肢。充分止血后縫合，消毒。大鼠蘇醒后正常予食水。術(shù)后次日分別測(cè)量各組大鼠體長(zhǎng)，通過(guò)調(diào)整鼠箱頂部食物及給水管至箱底墊料高度，使大鼠在攝食進(jìn)水時(shí)須保持無(wú)依托直立。之后每周測(cè)量大鼠長(zhǎng)度，并適當(dāng)調(diào)整食水位置。自首次調(diào)整食水高度4 周后，隨機(jī)取模型組及對(duì)照組中共2 只大鼠處死，取材，切片觀察腰椎間盤(pán)形態(tài)學(xué)改變情況，確認(rèn)模型復(fù)制是否成功。

2.2 給藥

活血補(bǔ)腎方：根據(jù)“人和動(dòng)物間體表面積折算等效劑量比率表”計(jì)算大鼠等效生藥劑量為4.59 g·kg-1[21]。1劑藥物加入適量蒸餾水浸泡0.5 h，煎制2次，將兩次藥液混合并濃縮至220 mL。按1 mL/100 g體重的比例灌胃，2 次/天，給藥6 周。雷帕霉素：將雷帕霉素1 mg溶于二甲基亞砜（DSMO）1 mL中，按0.1 mg/100 g體重比例腹腔注射給藥，1次/天，給藥6周。

表1 Thompson椎間盤(pán)退變分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

2.3 取材

末次給藥24 h 后，注射過(guò)量水合氯醛處死大鼠。各組中6 只大鼠取L5/6 椎間盤(pán)及上下相鄰椎體，10% 中性甲醛溶液固定，準(zhǔn)備切片染色。另6只大鼠取L5/6 椎間盤(pán)組織，經(jīng)液氮罐速凍后移入-80℃冰箱凍存，準(zhǔn)備行Western-Blot檢驗(yàn)。

2.4 染色

樣本經(jīng)10% 甲醛固定后，足量10% 稀硝酸脫鈣，將注射器針頭穿刺椎體骨質(zhì)無(wú)阻力時(shí)視為脫鈣終點(diǎn)，流水沖洗脫酸。依次進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋。于脊柱矢狀位切取6 μm切片。每個(gè)樣本均分別進(jìn)行HE 染色和阿爾新蘭-核固紅復(fù)合染色。中性樹(shù)脂封片后，顯微鏡觀察、評(píng)價(jià)并拍照存檔。HE 染色切片按照Thompson椎間盤(pán)退變分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[22]（表1）對(duì)退變情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。阿爾新蘭-核固紅復(fù)合染色對(duì)椎間盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白聚糖進(jìn)行染色，對(duì)比細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白聚糖含量及分布情況。

2.5 Western-blot

配置裂解液并加入PMSF（100:1）混勻，凍存樣本處理后加入裂解液，常規(guī)裂解，離心，取上清液。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，配置BCA 工作液，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下檢測(cè)空白樣品，檢測(cè)蛋白濃度。灌膠，計(jì)算所需蛋白體積。樣本置入電泳槽內(nèi)電泳，用TTBS 配制I抗工作液，lc3b 抗體(1∶1000)、beclin-1 抗體(1∶500)、p70S6K抗體(1∶500)和4E-BP1 抗體(1∶500)，PVDF 膜入I抗雜交袋中4℃孵化過(guò)夜。TTBS 洗滌PVDF 膜后移入孵育辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶3000)37℃孵化2 h。將PVDF 膜置于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)，滴加ECL 發(fā)光液后行暗室曝光，對(duì)曝光結(jié)果進(jìn)行掃描拍照。

3 數(shù)據(jù)處理

Western-blot 所取得實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Smart J 進(jìn)行灰度提取。所得數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和多重比較（LSD法）進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 HE染色

模型組：Thompson 3 級(jí)，椎間盤(pán)退變明顯，纖維環(huán)排列紊亂，髓核皺縮，終板不連續(xù)，椎體邊緣可見(jiàn)明顯增生，椎間隙高度變小。雷帕霉素組及活血補(bǔ)腎方組Thompson 2級(jí)，椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)均較為完整，纖維環(huán)排列不規(guī)整，髓核輕度皺縮，軟骨終板厚度不均；聯(lián)合組Thompson 2級(jí)，椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，椎間盤(pán)高度未見(jiàn)明顯丟失，纖維環(huán)排列不規(guī)整，髓核皺縮不明顯，軟骨終板增厚，椎體邊緣未見(jiàn)骨贅。活血補(bǔ)腎方、雷帕霉素組和聯(lián)合組略有差異但均為T(mén)hompson 2 級(jí)；對(duì)照組：椎間盤(pán)Thompson 1級(jí)，結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常，無(wú)明顯退變（圖1）。

4.2 阿爾新蘭-核固紅復(fù)合染色

模型組：染色最淺且面積最??；雷帕霉素組、活血補(bǔ)腎組及聯(lián)合組：染色介于模型組與對(duì)照組之間，且聯(lián)合組染色程度及面積僅較對(duì)照組略低；對(duì)照組：染色較深，且染色面積最大（圖2）。

4.3 腰椎間盤(pán)內(nèi)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)（圖3，表2）

4.3.1 mTOR信號(hào)通路下游相關(guān)蛋白檢測(cè)

p70S6K 表達(dá)情況：F=106.288，P=0.000，存在顯著差異。多重比較顯示：各給藥組均與模型組有顯著差異（P＜0.05），活血補(bǔ)腎方組與雷帕霉素組之間差異不明顯（P＞0.05）。p70S6K表達(dá)水平為：模型組最高，雷帕霉素組、活血補(bǔ)腎方組次之，聯(lián)合組最低。4EBP1 表達(dá)情況：F= 52.414，P= 0.000，存在顯著差異（P＜0.05）。多重比較顯示：各給藥組均與模型組有顯著差異（P＜0.05），聯(lián)合組與雷帕霉素組差異不明顯（P＞0.05）。4E-BP1表達(dá)水平為：模型組最高，活血補(bǔ)腎方組次之，雷帕霉素組、聯(lián)合組兩組最低（圖4）。

圖1 腰椎間盤(pán)組織形態(tài)學(xué)改變（HE染色×40）

圖2 腰椎間盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白聚糖含量（阿爾新蘭-核固紅染色，×40）

4.3.2 自噬相關(guān)蛋白beclin-1、lc-3b

beclin-1表達(dá)情況：F=113.648，P=0.000，差異顯著。多重比較顯示：各組間均差異明顯（P＜0.05）。lc-3b表達(dá)情況：F=160.328，P=0.000，差異顯著。多重比較顯示：各組間差異明顯（P＜0.05）。beclin-1 及l(fā)c-3b表達(dá)水平均為：聯(lián)合組>活血補(bǔ)腎方組>雷帕霉素>模型組>對(duì)照組（圖5）。

5 討論

5.1 調(diào)控自噬與抑制IDD的關(guān)系

椎間盤(pán)內(nèi)的髓核細(xì)胞通過(guò)分泌ECM 維持椎間盤(pán)的功能，其數(shù)量減少和隨之而來(lái)的ECM代謝失衡是椎間盤(pán)退變的病理生理變化基礎(chǔ)。一般認(rèn)為，IDD 的發(fā)生主要與髓核細(xì)胞自噬的失控和ECM（包括蛋白多糖和Ⅱ型膠原）合成與分解代謝的失衡有關(guān)[23]。自噬是機(jī)體應(yīng)對(duì)外界刺激，維持穩(wěn)態(tài)的一種機(jī)制。為維持髓核細(xì)胞的完整性和良好的生存狀態(tài)，正常的髓核細(xì)胞內(nèi)保持著一定水平的自噬。同時(shí)，自噬又與IDD 關(guān)系密切，在炎癥和乳酸堆積等不同條件下，自噬分別扮演著不同的角色，是一把“雙刃劍”[23]，既可以延緩NP 細(xì)胞的退變，又會(huì)促進(jìn)其退變，表現(xiàn)為雙向調(diào)節(jié)作用。在退變的椎間盤(pán)中，炎癥因子IL-1β、TNF-α及其誘導(dǎo)的ECM降解主要酶——MMPs等都有極高的表達(dá)。研究表明，激活自噬可以通過(guò)抑制以上炎癥因子的表達(dá)，達(dá)到防止ECM降解的目的[24]，還可以通過(guò)抑制退變NP細(xì)胞的凋亡，共同起到延緩椎間盤(pán)退變的作用[25]。

圖3 腰椎間盤(pán)內(nèi)p70S6K、4E-BP1、beclin-1、lc-3b相對(duì)表達(dá)量

同時(shí)，信號(hào)通路也是近年IDD 研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。椎間盤(pán)退變過(guò)程涉及到的信號(hào)通路有10余條，其中加速退變的通路有mTOR、NF-κB、Wnt/β-catenin、p38 MAKP及JNK，延緩?fù)俗兊耐酚蠵I3K/Akt、ERK1/2、Notch、Hedgehog 和RhoA/ROCK，信號(hào)通路間還存在復(fù)雜的相互協(xié)同與拮抗。對(duì)信號(hào)通路及其影響的相關(guān)研究能將炎癥因子、基因、蛋白等的表達(dá)情況，以及自噬、細(xì)胞凋亡進(jìn)行聯(lián)系并組成網(wǎng)絡(luò)，有望闡明IDD的詳細(xì)過(guò)程和形成機(jī)制。

表2 腰椎間盤(pán)內(nèi)p70S6K、4E-BP1、beclin-1、lc-3b相對(duì)表達(dá)量（n=5，±s）

圖4 mTOR信號(hào)通路下游p70S6K、4E-BP1蛋白相對(duì)含量

圖5 自噬相關(guān)蛋白beclin-1、lc-3b檢測(cè)結(jié)果

髓核細(xì)胞內(nèi)自噬也受到信號(hào)通路的調(diào)控，根據(jù)其不同信號(hào)通路的介導(dǎo)，自噬分為經(jīng)典的mTOR 通路依賴性自噬和非mTOR 通路依賴性自噬[19]，前者在椎間盤(pán)退變中起主導(dǎo)作用[26]。mTOR 通路依賴性自噬水平與mTOR 信號(hào)通路活化程度密切相關(guān)，可通過(guò)激活及抑制mTOR 信號(hào)通路進(jìn)行有效調(diào)控。mTOR 信號(hào)通路中存在2種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑mTORC1和mTORC2，mTORC1信號(hào)途徑通過(guò)對(duì)自噬相關(guān)基因（autophagy associated gene，ATG）的表達(dá)調(diào)控自噬水平[27]，ATG1 是啟動(dòng)自噬的關(guān)鍵蛋白激酶[28]，ATG1/ULK1 復(fù)合物是自噬的原核[29]，mTORC1信號(hào)途徑的下游蛋白S6K會(huì)抑制自噬原核ATG1/ULK1 復(fù)合物的形成，抑制自噬的表 達(dá)[30]。因此，對(duì)mTORC1 信號(hào)途徑的調(diào)控，是調(diào)節(jié)NP 細(xì)胞自噬的核心問(wèn)題。雷帕霉素是一種mTOR信號(hào)通路特異性抑制劑，研究表明能夠用過(guò)抑制mTORC1 信號(hào)途徑延緩椎間盤(pán)退變[31]。

自噬的過(guò)程需要經(jīng)過(guò)形成自噬體，包裹底物，形成自噬泡，與溶酶體融合，完成底物降解的過(guò)程。其中，胞質(zhì)性lc-3（lc-I）和膜性lc-3（lc-ll）是判斷細(xì)胞中自噬體形成的重要標(biāo)記，目前被認(rèn)為是檢驗(yàn)自噬的標(biāo)志性蛋白。而B(niǎo)eclin-1是自噬體形成過(guò)程中介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于自噬泡的關(guān)鍵分子，與lc-3共同作為檢測(cè)自噬水平的標(biāo)志基因來(lái)觀察自噬水平[32]。4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）和核糖體蛋白S6 激酶1（p70S6K）是mTOR 下游最具特色的效應(yīng)器，是mTOR 信號(hào)通路功能的主要執(zhí)行者，在這條信號(hào)通路中，mTOR主要通過(guò)調(diào)控P70S6K 和4E-BP1 來(lái)影響細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。因此，4E-BP1 和p70S6K 的水平變化將反映藥物對(duì)mTOR信號(hào)通路干預(yù)是否有效。

5.2 中藥防治IDD機(jī)制的研究

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)針對(duì)中藥治療IDD 機(jī)理的研究開(kāi)展得非常活躍。無(wú)論是動(dòng)物模型的復(fù)制，還是實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè)，多與國(guó)際接軌?，F(xiàn)在的趨勢(shì)是從探討是否改善椎間盤(pán)的微循環(huán)［33］，調(diào)節(jié)退變椎間盤(pán)髓核組織膠原形成過(guò)程[34]，抑制髓核內(nèi)炎性介質(zhì)的釋放與表達(dá)［35，36]，減緩NP細(xì)胞凋亡[37]層面向影響基因表達(dá)、影響信號(hào)通路水平深入[38-42]。

信號(hào)通路是近年來(lái)IDD研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。中藥研究也不例外，通過(guò)對(duì)中藥影響信號(hào)通路的研究，能將炎癥因子、基因、蛋白等的表達(dá)情況進(jìn)行聯(lián)系并組成網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)對(duì)信號(hào)通路及其作用影響的相關(guān)研究，有望在分子層面闡明中醫(yī)藥防治IDD的作用機(jī)制。

中醫(yī)藥的相關(guān)研究主要集中在NF-κB、MAPK 及Wnt等經(jīng)典信號(hào)通路。研究對(duì)象多取自臨床常用的經(jīng)方、驗(yàn)方及中藥有效成分等[38-42]，尤以補(bǔ)益肝腎及溫補(bǔ)腎陽(yáng)類為主，并取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如六味地黃丸對(duì)p38 MAPK 及JNK 兩條信號(hào)通路均存在抑制作用，能減少通路相關(guān)mRNA 及蛋白的表達(dá)，抑制p38 MAPK 信號(hào)通路的激活，并減輕由TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減緩NP細(xì)胞的凋亡[40]。淫羊藿素能夠通過(guò)抑制Hedgehog 信號(hào)通路的蛋白表達(dá)，減緩由力學(xué)刺激引起的終板軟骨細(xì)胞凋亡，但暫未明確其抑制作用的具體靶點(diǎn)[41]。川芎內(nèi)酯能減輕IL-1β誘導(dǎo)的NP細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解，以減輕椎間盤(pán)的退變[42]。但研究仍需繼續(xù)深入進(jìn)行，為實(shí)現(xiàn)IDD 的中醫(yī)藥精準(zhǔn)治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

5.3 獨(dú)活寄生湯治療IDD作用機(jī)制的研究

近年來(lái)，針對(duì)獨(dú)活寄生湯治療IDD 的作用機(jī)制的研究也從對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響層面深入到對(duì)信號(hào)通路的研究，有望闡明該方治療IDD 的作用機(jī)理。研究表明，獨(dú)活寄生湯提取物對(duì)椎間盤(pán)內(nèi)IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)有促進(jìn)作用[15]。并通過(guò)降低纖維環(huán)細(xì)胞內(nèi)P38 絲裂原活化蛋自激酶磷酸化水平，抑制炎性因子的產(chǎn)生，減緩由P38 絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡進(jìn)程[16,43]。該方經(jīng)由SDF-1/CXCR4 信號(hào)軸抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活，降低NP細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-1、MMP-3、MMP-13含量，并增加蛋白聚糖及Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)[17,44]。該方水提物組下調(diào)Wnt4、GSK-3β、β-catenin 和上調(diào)DKK-1mRNA 與蛋白表達(dá)，起到延緩椎間盤(pán)退變和調(diào)控退變椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞的功能[45]。但通過(guò)調(diào)控mTOR信號(hào)通路活性調(diào)節(jié)椎間盤(pán)內(nèi)自噬水平，從而延緩椎間盤(pán)退變這方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。

本次實(shí)驗(yàn)所觀察的活血補(bǔ)腎方為獨(dú)活寄生湯拆方而來(lái)，前期研究表明，活血補(bǔ)腎方及其拆方能通過(guò)影響IL-1β、TNF-αmRNA、Fas 表達(dá)和NP 細(xì)胞的凋亡率起到抑制椎間盤(pán)退變作用的[46,47]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，mTOR 信號(hào)通路下游蛋白表達(dá)下調(diào)，同時(shí)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平上調(diào)，即活血補(bǔ)腎方能夠通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路活性，提高椎間盤(pán)內(nèi)自噬水平，從而達(dá)到延緩椎間盤(pán)退變的目的，并且主要影響mTOR 信號(hào)通路中mTORC1信號(hào)途徑。但是本次研究?jī)H涉及mTOR 信號(hào)通路及其介導(dǎo)的自噬部分，對(duì)于椎間盤(pán)退變的其他信號(hào)通路、非mTOR 依賴性自噬及凋亡等因素的影響未能明確。仍需開(kāi)展大量相關(guān)研究，為該方的臨床應(yīng)用提供更為堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。