馬兜鈴酸安全性研究的評(píng)述觀點(diǎn)
——本刊專題特約評(píng)論

2019 年馬兜鈴酸致癌性研究筆談

1 葉祖光研究員 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥所

關(guān)于馬兜鈴酸毒性作用之管見(jiàn)

自上世紀(jì)90 年代比利時(shí)減肥門診部發(fā)現(xiàn)服用含馬兜鈴酸的中藥廣防己之后，引起了國(guó)內(nèi)外對(duì)含馬兜鈴酸中藥毒性的重視。我國(guó)國(guó)家藥監(jiān)局2003-2004年，先后取消了關(guān)木通、廣防己和青木香的藥材標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其他含有馬兜鈴酸的中藥也采取的監(jiān)管限制使用的措施，其后在《中華人民共和國(guó)藥典》（2005年版）將細(xì)辛原來(lái)是全草入藥修改為其藥用部位為根及根莖。通過(guò)上述一系列的監(jiān)管措施，至少在我國(guó)在較高程度上杜絕了因服用含有馬兜鈴酸而造成的毒副作用。其后在我國(guó)鮮有含馬兜鈴酸中藥毒副作用的報(bào)道。

然而，2017 年10 月18 日，Science子刊Science Translational Medicine發(fā)表的一篇文章題為“Aristolochic acids and their derivatives are widelyimplicated in liver cancers in Taiwan and throughout Asia”將似乎已經(jīng)沉寂多年的馬兜鈴酸毒性泛起而涌向公眾、學(xué)者、管理部門面前。該文主要觀點(diǎn)是，服用含有馬兜鈴酸中藥是引起我國(guó)肝癌的原因，其重要依據(jù)是：發(fā)現(xiàn)了馬兜鈴酸所引起的DNA 堿基對(duì)特異性突變（A-T 顛換突變：馬兜鈴酸特異性指紋）。上述觀點(diǎn)在我國(guó)學(xué)術(shù)界引起諸多質(zhì)疑。

根據(jù)國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道，馬兜鈴酸的毒性大致有兩大類：一是腎臟毒性，作用在腎小管容易導(dǎo)致腎衰；二是致癌性。我們需要回答的是，上述兩類毒性，哪個(gè)對(duì)馬兜鈴酸更敏感？腎臟是不是馬兜鈴酸最敏感的毒性靶器官？現(xiàn)在似乎還沒(méi)有肯定的結(jié)論；其次其致癌性是肯定的，因?yàn)椴簧賹?shí)驗(yàn)證明，馬兜鈴酸可以引起泌尿系統(tǒng)的癌癥、胃癌、肝癌等，但馬兜鈴酸致肝臟癌變是容易發(fā)生表征的致癌性，換言之，肝臟是馬兜鈴酸致癌性最容易攻擊的臟器？至今沒(méi)有實(shí)驗(yàn)研究證明這一點(diǎn)。上述兩個(gè)問(wèn)題需要學(xué)術(shù)界進(jìn)行研究，首先要明確馬兜鈴酸毒性的最敏感的靶器官是腎臟，還是肝臟？其次其致癌性到底主要表現(xiàn)在泌尿系統(tǒng)，還是肝臟、胃部等消化系統(tǒng)；此外，這兩類毒性作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是否一樣的，是馬兜鈴酸/馬兜鈴酰酸內(nèi)酰胺？明確上述問(wèn)題不僅有助于預(yù)防、監(jiān)控含馬兜鈴酸中藥毒副作用，而且還有學(xué)術(shù)和理論意義。在研究中建議首先重視量-毒關(guān)系的研究，尤其是加大時(shí)-毒關(guān)系的研究力度（目前罕見(jiàn)時(shí)毒關(guān)系的研究論文），在通過(guò)平行比較實(shí)驗(yàn)，確定馬兜鈴酸的最早發(fā)生的毒性反應(yīng)是什么？最敏感的毒性靶器官是哪個(gè)臟器？在上述工作基礎(chǔ)上，再開(kāi)展其毒性物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)理等深入研究的內(nèi)容。此外，在試驗(yàn)中盡量采用和臨床服藥相一致的給藥途徑，亦即采用口服給藥的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這樣的結(jié)果可能更接近臨床實(shí)際情況。不同的給藥途徑可能會(huì)產(chǎn)生不同組織器官的癌變，例如馬兜鈴酸口服給藥，其在胃腸道暴露量就比較高，那么產(chǎn)生胃部或腸道腫瘤的可能性就會(huì)較大，但馬兜鈴酸注射給藥（腹腔內(nèi)或靜脈注射），可能因其胃腸道暴露量的下降而對(duì)胃腸道致癌的可能性也隨之下降。至于馬兜鈴酸所致泌尿系統(tǒng)的癌變，可能與其主要通過(guò)尿液排泄這一藥代特征有關(guān)。

此外，關(guān)于2017年10月18日，Science子刊Science Translational Medicine 發(fā)表的一篇文章，其最大質(zhì)疑的關(guān)鍵點(diǎn)是：所謂馬兜鈴酸特異性指紋是否證據(jù)確鑿？因?yàn)楝F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)其他的致癌物也可以引起同樣的DNA堿基對(duì)突變，因此需要多家實(shí)驗(yàn)室和多種致癌物進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)。至于中國(guó)的肝癌和中國(guó)服用含馬兜鈴酸中藥密切相關(guān)這一結(jié)論其依據(jù)確有薄弱之嫌，在中國(guó)藥監(jiān)局采取一系列監(jiān)管措施之后，而且含馬兜鈴酸中藥的被明顯遏制使用之后的10余年，還將誘發(fā)肝癌原因加載到含馬兜鈴酸中藥上，明顯缺乏論據(jù)支點(diǎn)，因?yàn)樵?003-2005 年期間藥監(jiān)部門采取了一系列措施禁用、限用的監(jiān)管措施之后，服用此類中藥的人群已經(jīng)大幅度減少了，在服用含馬兜鈴酸中藥的人群數(shù)量明顯減少的背景下，仍然認(rèn)為中國(guó)大陸肝癌患者近一半（47% ）是和服用馬兜鈴酸有關(guān)，這個(gè)結(jié)果難以令人信服。眾所周知，中國(guó)的肝炎發(fā)病率居世界之首，學(xué)術(shù)界普遍的共識(shí)是：中國(guó)肝癌發(fā)生原因主要和肝炎密切相關(guān)，因此任何關(guān)于肝癌的誘因，不排除肝炎這個(gè)主要因素，其結(jié)論必然是脆弱的且容易受到人們的質(zhì)疑。這里存在一個(gè)最關(guān)鍵的問(wèn)題：肝癌組織DNA堿基對(duì)突變（A-T 顛換突變）是不是馬兜鈴酸所引起的特異性突變。因?yàn)檫@篇文章有關(guān)肝癌和馬兜鈴酸的因果關(guān)系的建立就基于這個(gè)“馬兜鈴酸特異性指紋”上。關(guān)于這個(gè)特異性變化，需要多個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用多種方法學(xué)加以驗(yàn)證。

鑒于上述，有關(guān)馬兜鈴酸毒性還存在較多的疑問(wèn)，尚需進(jìn)一步深入研究，積累實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，每一個(gè)結(jié)論需要有從不同角度和不同層次進(jìn)行研究的證據(jù)鏈來(lái)支撐。同時(shí)需要加強(qiáng)交流與合作，傾聽(tīng)各種意見(jiàn)和觀點(diǎn)，尤其要 加強(qiáng) 和2017 年10 月18 日，Science 子 刊Science Translational Medicine 那篇文章的作者及其研究團(tuán)隊(duì)的面對(duì)面的溝通與研討，通過(guò)坦誠(chéng)的學(xué)術(shù)交流，了解彼此的觀點(diǎn)并相互啟發(fā)，這樣有助于進(jìn)一步的毒理學(xué)研究規(guī)劃。在實(shí)驗(yàn)研究中，做到既有有組織有計(jì)劃的大項(xiàng)目，又有個(gè)體自由投標(biāo)的“小”課題。只有這樣才能集思廣益和博采眾家之長(zhǎng)，將馬兜鈴酸的毒理學(xué)研究從廣度和深度上更上一層樓。

2 肖小河研究員 中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心全軍中醫(yī)藥研究所

馬兜鈴酸毒性再研究的關(guān)鍵問(wèn)題及意義

馬兜鈴酸毒性問(wèn)題已經(jīng)不是一個(gè)新話題，但近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)注的熱度未曾降低。有人認(rèn)為馬兜鈴酸毒性問(wèn)題已然是根雞肋，沒(méi)有必要繼續(xù)研究，或者說(shuō)再研究也僅是對(duì)馬兜鈴酸進(jìn)行“鞭尸”。與此同時(shí)，也有人認(rèn)為值得深入研究。究竟如何看待呢？筆者認(rèn)為，馬兜鈴酸毒性問(wèn)題有必要深入研究，而且針對(duì)現(xiàn)有研究結(jié)果及意義的解讀更值得推究。

（1）馬兜鈴酸毒性再研究的幾個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題

就毒性靶點(diǎn)和靶器官角度而言，馬兜鈴酸具有腎毒性和致基因突變作用，可誘發(fā)腎衰竭和泌尿系統(tǒng)腫瘤已獲得充分證明，但馬兜鈴酸是否可誘導(dǎo)人產(chǎn)生肝癌，至今還沒(méi)有確定的結(jié)論；

就化學(xué)成分角度而言，馬兜鈴酸是一類結(jié)構(gòu)相似化合物的總稱，一般認(rèn)為馬兜鈴酸I 及其代謝產(chǎn)物是主要致?lián)p害物質(zhì)，但馬兜鈴酸類多種類似物以及體內(nèi)代謝產(chǎn)物是否均具有相同或相似毒性還有待研究；

就藥物品種角度而言，含馬兜鈴酸類成分的中草藥或中成藥有數(shù)十種，至今尚未對(duì)全部品種的安全性風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)評(píng)估，是否均需納入國(guó)家藥品及食品安全性監(jiān)管范圍，有待進(jìn)一步研究。

（2）馬兜鈴酸毒性問(wèn)題再研究的科學(xué)及現(xiàn)實(shí)意義

深入開(kāi)展馬兜鈴酸致肝癌的客觀性研究，有助于指導(dǎo)我國(guó)肝癌防治策略的制定。已有多篇研究論文報(bào)道了馬兜鈴酸與肝癌之間的相關(guān)性，但至今尚缺少直接和確鑿的證據(jù)，不同團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)論之間還存在相悖的現(xiàn)象，難以得出馬兜鈴酸是臨床肝癌發(fā)生誘因的結(jié)論。眾所周知，感染性肝病一直是我國(guó)乃至全球肝癌發(fā)生的主要誘因，我國(guó)以乙肝相關(guān)肝癌為主，如果一旦研究證實(shí)馬兜鈴酸為我國(guó)肝癌發(fā)生的另一重要誘因，這將大大改變?nèi)藗儗?duì)中國(guó)乃至國(guó)際肝癌誘因的傳統(tǒng)認(rèn)知，同時(shí)也可能促使我國(guó)的肝癌防治策略和重心發(fā)生重大調(diào)整。如果經(jīng)過(guò)深入系統(tǒng)的研究，否定了馬兜鈴酸致肝癌的客觀性，這不僅僅是為馬兜鈴酸及相關(guān)中藥洗脫了一大罪狀，更重要的是能有效避免誤導(dǎo)我國(guó)肝癌防治策略和措施的制定。

深入開(kāi)展馬兜鈴酸類成分相關(guān)毒性的研究，有助于提高我國(guó)對(duì)相關(guān)中藥及食品的科學(xué)監(jiān)管水平。馬兜鈴酸可誘發(fā)腎病和泌尿系統(tǒng)腫瘤已獲得證實(shí)，因此無(wú)論馬兜鈴酸是否誘導(dǎo)肝癌，從臨床用藥和科學(xué)監(jiān)管角度來(lái)說(shuō)，均應(yīng)嚴(yán)格管控。但是也需要指出，馬兜鈴酸是一類結(jié)構(gòu)相似化合物的總稱，這類化合物是否均具有致突變、致癌作用有待研究。此外，馬兜鈴酸廣泛存在于馬兜鈴屬和細(xì)辛屬中藥材原植物中，原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公布的收載于《中華人民共和國(guó)藥典》、部頒標(biāo)準(zhǔn)和地方藥材標(biāo)準(zhǔn)的馬兜鈴科藥材共24種，其中馬兜鈴屬藥材共14種，細(xì)辛屬藥材共10種，亟需明確這些藥材（尤其是藥用部位）及其相關(guān)中成藥是否含有致突變、致癌性的馬兜鈴酸成分及其潛在風(fēng)險(xiǎn)。另外，魚(yú)腥草作為藥食兩用品種，不僅是臨床用藥，也是常用蔬菜；文獻(xiàn)報(bào)道其含有多種馬兜鈴酸內(nèi)酰胺類似物，這些類似物是否也具有致突變、致癌作用有待研究。加強(qiáng)馬兜鈴酸致肝癌的研究，將為馬兜鈴酸相關(guān)藥品和食品的科學(xué)監(jiān)管提供新的重要依據(jù)。

深入開(kāi)展馬兜鈴酸毒理學(xué)及相關(guān)研究，有助于推動(dòng)毒理學(xué)學(xué)科的發(fā)展?？茖W(xué)探索無(wú)止境，馬兜鈴酸研究亦如此。特別是從分子和基因水平深入開(kāi)展馬兜鈴酸靶器官毒性及機(jī)制研究，有助于進(jìn)一步深化對(duì)馬兜鈴酸相關(guān)毒性的科學(xué)認(rèn)識(shí)。同時(shí)，往事不可追，來(lái)者猶可諫，正如史學(xué)家對(duì)歷史事件和人物進(jìn)行窮經(jīng)皓首地探究一樣。馬兜鈴酸毒性無(wú)論是作為藥源性疾病研究范例，還是作為毒理學(xué)研究范例，亦或是藥品安全監(jiān)管范例，均具有代表性和里程碑意義，也將有力推動(dòng)毒理學(xué)學(xué)科的創(chuàng)新發(fā)展。

3 楊凌教授上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)學(xué)院

關(guān)于馬兜鈴酸可能會(huì)有如下?tīng)?zhēng)議：1.AAs 是指哪些化學(xué)物質(zhì)？2、致癌物與基因毒的定義？3、加合物、基因毒與致癌作用的關(guān)系？4、AAs 構(gòu)毒關(guān)系？5、盡管通過(guò)口服，馬兜鈴酸引發(fā)的主要病變?yōu)楹问悄I臟如腎纖維化、腎癌為主？其它臟器包括肝癌為次？致腎癌與致肝癌可能會(huì)有哪些具體機(jī)制上的不同？6、“A:T→T:A 顛換突變”與“AAs-加合物”是什么關(guān)系？“A:T→T:A顛換突變”是AAs特征性的嗎？7、一般的致癌機(jī)制證明過(guò)程與方法論？8、什么致癌的直接臨床證據(jù)？在臨床研究中怎樣正確使用統(tǒng)計(jì)學(xué)？什么是偶合現(xiàn)象？怎樣甄別？9、在AAs的致癌過(guò)程中，抑癌基因的突變才是決定性的嗎？10、動(dòng)物模型的可靠性與代表性？有哪些重要因素與考量？11、藥物代謝對(duì)AAs致毒的影響？哪些代謝酶起到關(guān)鍵作用？是保護(hù)作用還是加害作用？AAs 結(jié)構(gòu)與代謝關(guān)系與規(guī)律？12、轉(zhuǎn)運(yùn)體在AAs 致癌過(guò)程中可能發(fā)揮怎樣的作用？13、藥物代謝與藥動(dòng)學(xué)是一回事嗎？14、病毒等致癌的特點(diǎn)與AAs致癌特點(diǎn)有何不同？有混淆的可能嗎？

4 韓澤廣教授上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院

馬兜鈴酸導(dǎo)致肝癌

20世紀(jì)90年代，研究者發(fā)現(xiàn)馬兜鈴酸（aristolochic acid，AA；主要包含AAⅠ和AAⅡ）能夠引起馬兜鈴酸腎病[1-4]，繼而發(fā)現(xiàn)馬兜鈴酸能夠引起尿路上皮癌[5,6]，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為Ⅰ類人類致癌物。馬兜鈴酸作為具有遺傳毒性的化學(xué)致癌物，其代謝產(chǎn)物能夠與嘌呤堿基結(jié)合形成AA-DNA 加合物—馬兜鈴內(nèi)酰胺（aristolactam,AL）-DNA加合物（dA-AL和dG-AL），后者作為AA 暴露的特異標(biāo)志物，能夠引起以A>T 顛換為特點(diǎn)的DNA 突變[7,8]，對(duì)應(yīng)的突變指紋為COSMIC signature 22 （https://cancer.sanger.ac.uk/ cosmic/signatures）。突變指紋是指某種因素引起的突變過(guò)程在基因組上形成的特定突變圖譜[9]。

2012 年，我們對(duì)國(guó)內(nèi)乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）相關(guān)的肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）樣本進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，首次發(fā)現(xiàn)40% （4/10）的HCCs 顯著富集A>T 顛換[10]，提示AAs 可能對(duì)HCC發(fā)生具有重要作用。2013年，新加坡的研究者通過(guò)分析已發(fā)表的88 例中國(guó)HCC 病人的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)有10 例具有較高比例的特征A>T 突變[11]。2017 年10 月，一項(xiàng)來(lái)自新加坡和臺(tái)灣學(xué)者的研究指出，通過(guò)對(duì)98 例臺(tái)灣HCC 患者進(jìn)行全外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)78% 的患者具有特殊突變指紋（signature 22）[12]，這可能與大約1/3臺(tái)灣居民服用過(guò)含有AA的中草藥有關(guān)[13]。同時(shí)他們還分析了包含多個(gè)國(guó)家或地區(qū)的已發(fā)表的HCC病人的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)較高比例的亞洲地區(qū)HCC病人具有signature 22，而歐洲和北美則較低[12]。AA 相關(guān)突變指紋signature 22 在眾多HCC 病人中存在，很大程度上提示AA可能與HCC有關(guān)。

為了評(píng)價(jià)AA與肝癌的關(guān)系，我們以AA相關(guān)突變指紋signature 22 作為AA 暴露的指示標(biāo)記，分析了公共數(shù)據(jù)中或已發(fā)表的來(lái)自不同國(guó)家或地區(qū)的包括HCC、肝內(nèi) 膽管 癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）、肝細(xì)胞癌-肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌混合癌（combined hepatocellular and intrahepatic cholangiocarcinoma, cHCCICC）、腎細(xì)胞癌（renal cell cancer,RCC）、膀胱癌（bladder cancer,BC）和食道癌（esophagus cancer,EC）在內(nèi)的多種類型腫瘤的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在多種類型腫瘤中，不同類型的肝癌患者均呈現(xiàn)較高的AA 相關(guān)突變指紋（圖A），尤其來(lái)自中國(guó)的肝癌患者有AA相關(guān)突變指紋比例最高[14]。

圖1 馬兜鈴酸導(dǎo)致肝癌

肝癌患者有signature 22是否反映AA在肝癌發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用存在爭(zhēng)議。Signature 22 是通過(guò)數(shù)學(xué)方法從已知AA暴露的上尿路上皮癌患者的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)中分析所獲得的[11,15]，其以A>T 突變?yōu)橹鳎渌麎A基類型的突變則非常少，突變主要集中在非轉(zhuǎn)錄鏈上。根據(jù)以往研究，除了AA，能引起A>T 突變的化合物還包括7，12-二甲基苯（7,12-dimethylbenzanthracene,DMBA）[16]、二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine,DEN）[17]、4-氨基聯(lián)苯（4-aminobiphenyl, 4-ABP）[18]和氯乙烯（vinyl chloride,VC）[19,20]等。由DMBA 誘導(dǎo)的小鼠皮膚鱗狀細(xì)胞癌的突變圖譜盡管以A>T 突變?yōu)橹鳎ù笥?0% ），但是與signature 22具有差異[16]。DEN誘導(dǎo)的小鼠HCC的突變圖譜盡管以A>T突變?yōu)橹?，但是其他類型堿基突變也很高[17]；4-ABP 可以引起小鼠肝癌C>A或A>T 突變[17]，VC 引起人和小鼠肝癌（HCC 和肝血管肉瘤）A>T 或G>A 突變[19,21-24]。因此，僅僅以A>T 突變指紋作為判定AA暴露導(dǎo)致肝癌的結(jié)論不夠嚴(yán)謹(jǐn)。

為了證明AA 是否能夠引起肝癌，我們從2015 年開(kāi)始觀察AAI 是否能引起小鼠肝癌，在2017 年3 月即發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用AAI 可以引起小鼠肝癌（包括HCC 和ICC）。如果與肝損傷藥物如四氯化碳（CCL4）合用則明顯增加肝癌發(fā)生。這些小鼠肝癌呈現(xiàn)典型突變指紋signature 22，導(dǎo)致Hras突變。更有意義的是，我們用質(zhì)譜方法發(fā)現(xiàn)一些人肝癌樣本中含有AAI-DNA加合物，也具有典型突變指紋signature 22。在人肝癌中可累及多個(gè)重要基因，尤其TP53 和JAK1 兩個(gè)基因。這樣我們通過(guò)小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、人和肝AAI-DNA加合物檢測(cè)以及肝癌基因組測(cè)序數(shù)據(jù)分析可以明確AAI導(dǎo)致肝癌[14]。其機(jī)制可能是，AAI 經(jīng)代謝活化后與腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤反應(yīng)形成AAI-DNA加合物，導(dǎo)致DNA損傷；經(jīng)過(guò)DNA損傷修復(fù)，大部分可以修復(fù)，但其中一些形成A>T突變并經(jīng)DNA 復(fù)制保留下來(lái)，若形成的A>T 突變發(fā)生在Hras（小鼠）和TP53（人類）等重要基因上則會(huì)導(dǎo)致小鼠和人類肝癌的發(fā)生（圖1B）。

盡管AA 導(dǎo)致肝癌的研究還需要進(jìn)一步完善，如流行病學(xué)調(diào)查肝癌患者服用含AA 中草藥情況，是否與HBV 感染、脂肪性肝炎等協(xié)同導(dǎo)致肝癌，在大樣本肝癌患者隊(duì)列中調(diào)查AAI-DNA加合物等，但基于我們研究的結(jié)論，強(qiáng)烈建議肝病患者必須禁服含AA中草藥。

（摘自文章：The Mutational Features of Aristolochic Acid-induced Mouse and Human Liver Cancers）

中藥成分馬兜鈴酸致癌性的思考

（1）關(guān)于馬兜鈴酸與肝癌

我們前期轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型致突變研究結(jié)果表明AAs 并不會(huì)引起肝臟基因突變頻率的顯著升高，致突變的靶器官為前胃、腎臟和泌尿系統(tǒng)。迄今為止超過(guò)十余篇文獻(xiàn)報(bào)道的大鼠和小鼠的致癌實(shí)驗(yàn)也顯示，AAs 雖然可以導(dǎo)致多組織器官的腫瘤，但是卻并沒(méi)有誘發(fā)原發(fā)肝臟腫瘤。2019年7月發(fā)表在Hepatology[1]的動(dòng)物致癌實(shí)驗(yàn)中使用的小鼠為2周齡，尚處于哺乳期，

5 欒洋研究員上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院

相當(dāng)于人類1、2 歲嬰幼兒，幼年動(dòng)物在生長(zhǎng)期肝臟細(xì)胞分裂旺盛，馬兜鈴酸導(dǎo)致的DNA損傷和突變更容易通過(guò)細(xì)胞分裂被固定和傳遞下去，這可能是該論文能得出幼鼠誘發(fā)肝癌的原因。需要關(guān)注該論文的另一個(gè)點(diǎn)是四氯化碳前處理動(dòng)物后再給藥的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。四氯化碳常用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)肝損傷造模，該論文結(jié)果表明了肝臟有損傷時(shí)攝入馬兜鈴酸比非損傷狀態(tài)下更容易引發(fā)癌癥。此外，還有一項(xiàng)大鼠致癌實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)同時(shí)刺激肝臟細(xì)胞增殖時(shí)，AAs 才會(huì)誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生[2]。提示我們，AAs 如果具有致癌作用，可能需要其他一些肝臟損傷因素的協(xié)同，例如：慢性病毒性肝炎的感染。

流行病學(xué)研究表明中國(guó)肝癌首要致病因素為乙肝病毒。值得注意的是，有少數(shù)治療肝病的中成藥（如十三味疏肝膠囊、二十五味綠絨蒿膠囊/丸、二十五味松石丸等）含馬兜鈴科植物，由此難以避免馬兜鈴酸致癌毒性以及與炎癥的協(xié)同致癌作用?？梢酝茰y(cè)，可能有一些病人會(huì)長(zhǎng)期使用這一類中成藥來(lái)控制肝炎的病情，因此會(huì)同時(shí)暴露于AAs 和慢性肝炎病毒感染。在Steven.G.Rozen教授的研究中[3]，絕大多數(shù)有AAs相關(guān)的突變特征的病人同時(shí)也是慢性病毒性肝炎的患者。因此，要證明AAs 在肝癌中發(fā)揮的作用，首先要闡明AAs是否是一個(gè)獨(dú)立的肝致癌因素。需要排除例如慢性肝炎病毒感染的影響，以及其他明確的肝致癌物如食物來(lái)源的黃曲霉毒素的影響，才能得出馬兜鈴酸是否是肝致癌物的結(jié)論。因此，我們認(rèn)為，生物信息學(xué)分析應(yīng)該在非肝炎病人中檢測(cè)是否有AAs 的突變特征，并分析這種特征是否發(fā)生在關(guān)鍵的驅(qū)動(dòng)基因上。此外需要進(jìn)一步選擇合適的動(dòng)物模型對(duì)人群研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，闡明它與其他肝臟致癌因素或者肝損傷因素是否存在協(xié)同作用。綜合分析可能的致病因素如炎癥或其他環(huán)境致癌物如黃曲霉毒素對(duì)疾病的貢獻(xiàn)度，明確可用藥的目標(biāo)人群并制訂用藥方案。

（2）關(guān)于AAs致癌毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)

目前認(rèn)為馬兜鈴科植物腎毒性和致癌毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)主要包括兩大類物質(zhì)：馬兜鈴酸(AAs)和馬兜鈴內(nèi)酰胺(Aristololactams,ALs)。AAs 是一類化合物，植物中含量最多的前幾位是AAI、AAII、AAIII 和AAIVa。目前相關(guān)毒性研究報(bào)道多以AAI 單一成分或AA-I/AA-II 混合物作為研究對(duì)象，中國(guó)2015 版藥典中也只收錄了AAI 藥用標(biāo)準(zhǔn)。但是，這些類似物在不同藥材中的含量不同，AAs不同類似物毒性表現(xiàn)也可能不同，例如目前認(rèn)為AAI具有腎毒性而AAII不具有腎毒性，AAII 致癌風(fēng)險(xiǎn)高于AAI[4]。我們研究發(fā)現(xiàn)AAIVa 代謝活化后也能與DNA 發(fā)生反應(yīng)生成DNA 加合物，并且AAIVa 在一些藥材如天仙藤中含量遠(yuǎn)高于AAI 和AAII。此外，一般觀點(diǎn)認(rèn)為ALs 具有腎毒性，ALs 在食物折耳根中含量也較高，也是AAs在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，從機(jī)制上推斷ALs不易形成DNA加合物，但是研究數(shù)據(jù)較少，有待進(jìn)一步深入研究。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的馬兜鈴酸類似物已超過(guò)上百種，如何排查具有潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)的組分，我們認(rèn)為可采取國(guó)際相關(guān)指南中的替代方法，因?yàn)閯?dòng)物試驗(yàn)耗時(shí)、耗力、需要受試物的量大。例如我們正在對(duì)從文獻(xiàn)中檢索到的上百種馬兜鈴酸類似物應(yīng)用計(jì)算毒理學(xué)領(lǐng)域的定量構(gòu)效關(guān)系（QSAR）軟件進(jìn)行毒性預(yù)測(cè)，該類平臺(tái)是毒理學(xué)家常用的研究工具，已有多種公開(kāi)的或商業(yè)化軟件可用于預(yù)測(cè)致突變性及致癌性，這類平臺(tái)已應(yīng)用于危險(xiǎn)評(píng)定、藥物研發(fā)和監(jiān)管決策等領(lǐng)域。此外，我國(guó)中藥管理辦法中的技術(shù)要求還僅限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，因此采用高通量的替代方法有望實(shí)現(xiàn)對(duì)于具有潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)、具有化學(xué)警示結(jié)構(gòu)的中藥成分進(jìn)行排查。因此，哪些AAs 類似物能與DNA 生成加合物，其毒性差異如何？明晰致癌等毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)，才能更有針對(duì)性地制訂防治措施。

（3）關(guān)于其毒性閾值

理論上，以DNA為直接作用靶點(diǎn)的遺傳毒性致癌物不存在毒性閾值，傳統(tǒng)遺傳毒性評(píng)價(jià)多采用“陰性還是陽(yáng)性”一刀切的策略。但是，遺傳毒性致癌物進(jìn)入體內(nèi)后由于吸收、分布和代謝等原因，也存在“實(shí)際閾值”。近年來(lái)，國(guó)際上已提出遺傳毒性的評(píng)價(jià)應(yīng)從定性向定量轉(zhuǎn)變[5]，即通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，選擇合適的檢測(cè)終點(diǎn)，在低劑量范圍設(shè)計(jì)足夠多的劑量組，通過(guò)分析劑量-毒性效應(yīng)關(guān)系得出基準(zhǔn)劑量，再計(jì)算出毒性效應(yīng)起點(diǎn)。由于上述方法能夠?qū)撛谥掳╋L(fēng)險(xiǎn)特征進(jìn)行量化描述，該方法已被WHO 用于食物中遺傳毒性致癌物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[6]。因此我們認(rèn)為對(duì)馬兜鈴酸進(jìn)行定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)非常重要，例如可以通過(guò)基準(zhǔn)劑量法，選擇合適的檢測(cè)終點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)包括DNA加合物、染色體改變、基因突變等，通過(guò)分析劑量-毒性效應(yīng)關(guān)系得出基準(zhǔn)劑量，再計(jì)算出毒性效應(yīng)起點(diǎn)值，從而外推制訂可保障安全性的人群攝入限量標(biāo)準(zhǔn)。

（4）關(guān)于臨床研究

既然含馬兜鈴酸的藥用植物臨床要繼續(xù)使用，那么如何進(jìn)行毒性的監(jiān)測(cè)、預(yù)防和早期診治就成為一個(gè)重要的課題。目前尚缺少可以預(yù)測(cè)馬兜鈴酸毒性的生物標(biāo)志，未來(lái)是否可以利用方便易得的尿液或血液樣本，通過(guò)檢測(cè)蛋白加合物或脫落細(xì)胞DNA及游離DNA的加合物，結(jié)合目標(biāo)基因的突變測(cè)序分析，或許有望探索出馬兜鈴酸暴露的生物標(biāo)志；此外，應(yīng)用組學(xué)技術(shù)分析染毒后動(dòng)物的尿液或血液，結(jié)合臨床研究發(fā)現(xiàn)，也有可能得到指征毒性的生物標(biāo)志；另外，易感人群的鑒定也是重要的研究?jī)?nèi)容，馬兜鈴酸暴露之后，發(fā)病的僅為少數(shù)人，這也是馬兜鈴類藥物長(zhǎng)久應(yīng)用，而其危害性未被及時(shí)察覺(jué)的一個(gè)重要原因。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素P450 在馬兜鈴酸代謝解毒過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]，而代謝活化發(fā)揮遺傳毒性的代謝酶主要為硝基還原酶，但目前研究尚無(wú)定論。此外，遺傳學(xué)損傷修復(fù)基因在個(gè)體上也存在差異，因此，考察與馬兜鈴酸毒性密切相關(guān)的代謝酶或DNA損傷修復(fù)酶的遺傳多態(tài)性，作為易感標(biāo)志有望鑒定易感人群，明確是否能服用含有馬兜鈴酸的中藥。上述生物標(biāo)志鑒定課題是未來(lái)臨床研究中的挑戰(zhàn)。

馬兜鈴酸動(dòng)物致癌研究中發(fā)現(xiàn)，毒性靶器官除泌尿系統(tǒng)外，結(jié)腸的腫瘤發(fā)生率也較高。我們前期應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行致突變研究也發(fā)現(xiàn)，AAI 給藥后在結(jié)腸也引起了較高基因突變，上述結(jié)果提示結(jié)腸癌與馬兜鈴酸的相關(guān)性也需要關(guān)注。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索結(jié)腸癌測(cè)序數(shù)據(jù)，雖然未發(fā)現(xiàn)馬兜鈴酸的特征性突變，但是該數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的中國(guó)結(jié)腸癌人群數(shù)據(jù)幾乎為零，因此，中國(guó)人發(fā)病率日益升高的結(jié)腸癌是否與馬兜鈴酸暴露有關(guān)還需要系統(tǒng)深入的流行病學(xué)研究。尤其馬兜鈴酸致癌分子起始事件已明確為DNA加合物，那么在中國(guó)腸道腫瘤樣本中考察馬兜鈴酸DNA加合物，分析馬兜鈴酸特征性突變，可以為解答上述疑問(wèn)提供重要依據(jù)。目前，國(guó)際上還沒(méi)有中國(guó)主導(dǎo)的AAs 致癌作用的流行病學(xué)研究報(bào)道，迫切需要自主進(jìn)行系統(tǒng)臨床研究，結(jié)合中國(guó)人肝臟、泌尿系統(tǒng)和腸道腫瘤主要風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行綜合分析和判斷。

（5）馬兜鈴酸安全性研究需要中、西醫(yī)結(jié)合和多學(xué)科交叉

要闡明馬兜鈴酸的安全性，必須要加強(qiáng)中、西醫(yī)學(xué)間的合作交流。在遵守中藥是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下用藥的這一基本原則前提下，要引入現(xiàn)代技術(shù)手段，例如檢測(cè)馬兜鈴酸DNA 加合物時(shí)需要的分析化學(xué)技術(shù)如液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、檢測(cè)腫瘤組織中馬兜鈴酸特征突變所需的二代測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法、考察毒性作用通路的分子生物學(xué)方法、鑒定毒性生物標(biāo)志的組學(xué)技術(shù)、篩選馬兜鈴酸類似物所需的高通量、高內(nèi)涵毒性測(cè)試方法和計(jì)算毒理學(xué)方法。

此外，還需要不同學(xué)科之間進(jìn)行交叉合作。代謝活化是馬兜鈴酸致癌作用發(fā)揮的前提，因此，闡明代謝解毒/代謝活化的酶和相應(yīng)靶器官就非常重要，需要ADME 研究領(lǐng)域的學(xué)者加入；研究DNA 加合物的生成機(jī)理、自由基攻擊堿基的位點(diǎn)等均需要化學(xué)領(lǐng)域?qū)W者的合作；此外，與環(huán)境領(lǐng)域的合作也有待開(kāi)展，因?yàn)轳R兜鈴酸可經(jīng)由環(huán)境進(jìn)入人體，已有研究發(fā)現(xiàn)[8]馬兜鈴種子或植株散落于土壤中，分解出的馬兜鈴酸可在土壤中蓄積，再被作物所吸收和富集，構(gòu)成天然的經(jīng)食物鏈的毒物污染；此外，我們還與昆蟲(chóng)學(xué)家合作，試圖通過(guò)仿生學(xué)領(lǐng)域的研究破解專食馬兜鈴植物的昆蟲(chóng)體內(nèi)解毒機(jī)制。

總之，中、西醫(yī)結(jié)合和多學(xué)科交叉是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的精髓，也只有如此研究才能實(shí)現(xiàn)闡明馬兜鈴酸毒性機(jī)理，保障馬兜鈴科這一大類現(xiàn)有藥物的用藥安全性。

6 梁愛(ài)華研究員 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所

含馬兜鈴酸中藥：正視風(fēng)險(xiǎn)，合理用藥

馬兜鈴科植物約有500 余種，大都含有馬兜鈴酸（AAs: Aristolochic Acids）[1]。由于馬兜鈴酸具有明顯的腎臟毒性，并可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[2,3]，使得含馬兜鈴酸中藥的安全性問(wèn)題近年來(lái)持續(xù)引起社會(huì)廣泛的關(guān)注，尤其是對(duì)其致腫瘤問(wèn)題熱議不斷，既有共識(shí)，也有分歧。目前學(xué)術(shù)界對(duì)于馬兜鈴酸可導(dǎo)致腫瘤已有高度的共識(shí)，然而對(duì)于馬兜鈴酸究竟可引起哪些臟器腫瘤，尤其是對(duì)其是否引起肝癌分歧很大。另外，有觀點(diǎn)認(rèn)為，馬兜鈴酸引起腫瘤與劑量沒(méi)有關(guān)系，任何劑量只用一次就可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，因此，主張將含馬兜鈴酸中藥禁用。

本團(tuán)隊(duì)曾經(jīng)對(duì)含馬兜鈴酸中藥關(guān)木通進(jìn)行過(guò)大鼠長(zhǎng)期用藥的實(shí)驗(yàn)研究[4]，在動(dòng)物上觀察到腫瘤發(fā)生，現(xiàn)將主要結(jié)果簡(jiǎn)述如下，希望提供一些客觀信息。在該實(shí)驗(yàn)中采用6-8 周齡的SD 大鼠。關(guān)木通提取物設(shè)計(jì)了4 個(gè)劑量，根據(jù)提取物的馬兜鈴酸含量折算成馬兜鈴酸I 劑量分別為0.375、3.75、7.5、15 mg/kg；另設(shè)馬兜鈴酸組（15mg·kg-1）。灌胃給藥，隔日一次，共給藥6個(gè)月，部分動(dòng)物停藥后繼續(xù)觀察2 個(gè)月。于給藥后不同時(shí)間點(diǎn)分別處死各組部分動(dòng)物，以觀察腫瘤發(fā)生過(guò)程。結(jié)果顯示，關(guān)木通提取物在馬兜鈴酸劑量相同時(shí)，其造成腎臟損傷和引起腫瘤的情況相似，可引起腎腫瘤、膀胱腫瘤、皮下腫瘤、前胃腫瘤。但是，在本實(shí)驗(yàn)中，未見(jiàn)原發(fā)與肝臟的腫瘤。另外，腫瘤發(fā)生情況與劑量和用藥時(shí)間相關(guān)，3.75 mg/kg及以上各劑量組均可見(jiàn)以上腫瘤，發(fā)生腫瘤的動(dòng)物數(shù)與劑量呈正比，劑量越高，腫瘤發(fā)生時(shí)間越早。已有臨床報(bào)道，人服用含馬兜鈴酸中藥可造成腎間質(zhì)纖維化以及泌尿系統(tǒng)腫瘤[5-7]。上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察到腎臟和膀胱腫瘤的情況與臨床一致。而皮下腫瘤和胃腫瘤在臨床上并未發(fā)現(xiàn)。說(shuō)明動(dòng)物與人存在差異，因此，將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果推論到人仍需謹(jǐn)慎。近期韓澤廣教授發(fā)表文章顯示馬兜鈴酸可誘發(fā)肝癌[9]，但未見(jiàn)其他臟器腫瘤，研究結(jié)果與其他文獻(xiàn)報(bào)道有所不同，可能與該研究采用了更幼年的小鼠（2-3周齡）腹腔注射給藥有關(guān)。目前雖然有文獻(xiàn)報(bào)道指出，亞洲肝癌患者可檢測(cè)到“馬兜鈴酸指紋”的比例較高，然而，含馬兜鈴酸中藥是否直接引起人肝癌尚需進(jìn)一步研究。

無(wú)論含馬兜鈴酸中藥是否可引起肝癌，但其致泌尿系腫瘤的結(jié)論是明確的，因此，含馬兜鈴酸中藥的風(fēng)險(xiǎn)必須重視。從毒理學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看，任何藥物的毒性均與劑量和用藥時(shí)間相關(guān)，合理用藥對(duì)于防范風(fēng)險(xiǎn)是至關(guān)重要的。另外，有必要對(duì)含馬兜鈴酸中藥的中成藥制劑制定馬兜鈴酸限量標(biāo)準(zhǔn)，以避免用藥者攝入馬兜鈴酸過(guò)量而中毒。