大蒜素對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化干預(yù)作用及對(duì)腎組織TGF-β1/Smads 信號(hào)通路的影響

李希敏 徐 露 周 璐 邵田娛 梁珍珍

腎間質(zhì)纖維化是各種致病因素引起的進(jìn)行性腎損傷的主要病理特征，也是導(dǎo)致終末期腎臟病的共同進(jìn)程，然而目前臨床尚缺乏有效的治療方法逆轉(zhuǎn)這一過(guò)程。大蒜素化學(xué)名為二烯丙基三硫化物，是由大蒜經(jīng)水蒸汽蒸餾而得到的一種揮發(fā)油，也可通過(guò)人工合成。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外均有關(guān)于大蒜素對(duì)各類(lèi)腎損傷的保護(hù)作用研究[1-2]。實(shí)驗(yàn)研究證明，大蒜素對(duì)心肌、肝臟以及肺組織纖維化具有抑制作用，因此推測(cè)大蒜素對(duì)腎臟的間質(zhì)纖維化同樣具有改善效果[3-4]。本研究采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)（UUO）制備大鼠腎間質(zhì)纖維化模型，觀察大蒜素對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化的干預(yù)作用，初步探討其作用與TGF-β1/Smads 信號(hào)通路的關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD 大鼠18 只，清潔級(jí)，體質(zhì)量（150±20）g，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006，于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，許可證號(hào)：SYXK（浙）2018-0012，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理批件號(hào)ZSLL-2018-033，屏障環(huán)境，室溫20～26℃，濕度40%～70%，自由食水，7 天后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑 大蒜素（98%，25g）：上海源葉生物科技有限公司（批號(hào)S25256）；Masson 染色液：南京建成科技有限公司（批號(hào)D026-1-2）；小鼠抗人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）單克隆抗體：Santa Cruz公司（批號(hào)SC65378）；兔抗人磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子2（p-Smad2）單克隆抗體、羊抗人磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子3（p-Smad3）多克隆抗體、兔抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）單克隆抗體：杭州華安生物技術(shù)有限公司（批號(hào)ET1702-34，ET1607-43，ET1609-41）；DAB 試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（批號(hào)ZLI-9018）；HRP 標(biāo)記羊抗鼠二抗、兔二抗：Proteintech 公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備 STP120 脫水機(jī)、AP280-2 包埋機(jī)、HM335E 切片機(jī)：MICROM 公司；BG-270 隔水式電熱恒溫箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；蛋白電泳系統(tǒng)：Bio-Rad 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及腎間質(zhì)纖維化模型建立 18 只SD 大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組與大蒜素組，每組6 只，采用UUO 建立大鼠腎間質(zhì)纖維化模型。大鼠禁食24h 后，行腹腔麻醉，消毒，取左側(cè)腹部切口，暴露左側(cè)腎臟，用鑷子分離出輸尿管，于中上1/3 處結(jié)扎并剪斷，致左腎完全梗阻，將腎臟置于原位后，逐層縫合大鼠腹壁。假手術(shù)組僅分離輸尿管后直接縫合。

2.2 給藥 自造模術(shù)后第1 天，大蒜素組大鼠予大蒜素60mg·kg-1·d-1灌胃處理，假手術(shù)組及模型組每天予等量生理鹽水灌胃。第14 天，將所有大鼠放入代謝籠中，收集24h 尿液，隨后將大鼠麻醉，經(jīng)心臟取血，行腎臟原位灌洗去除血液，取下左腎并稱(chēng)重，將腎臟沿長(zhǎng)軸剖開(kāi)，一部分組織固定于10%中性福爾馬林緩沖液，用于制備病理切片，另一部分保存于-80℃冰箱，用于蛋白質(zhì)分析。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 體質(zhì)量及腎臟指數(shù) 分別于造模后當(dāng)天稱(chēng)量大鼠體質(zhì)量，第15 天稱(chēng)量大鼠體質(zhì)量及左腎質(zhì)量，計(jì)算腎臟指數(shù)[腎臟指數(shù)=左腎質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%]。

2.3.2 血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）及24h 尿蛋白檢測(cè) 采用尿蛋白試劑盒對(duì)尿液樣本進(jìn)行24h 尿蛋白定量測(cè)定，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清樣本的SCr 和BUN。

2.3.3 腎組織病理觀察 對(duì)部分腎組織進(jìn)行常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片及Masson 染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察腎間質(zhì)的纖維化情況。

2.3.4 腎組織TGF-β1、α-SMA 檢測(cè) 運(yùn)用免疫組化法分析腎組織TGF-β1 及α-SMA 表達(dá)。方法：將石蠟切片放置60℃烤箱烘烤2h，脫蠟、水化，蒸餾水洗滌后，將切片浸入修復(fù)液，高壓熱修復(fù)，加入3%H2O2溶液10min，阻斷過(guò)氧化物酶，PBS 洗滌5min，3次。加入一抗，37℃下孵育60min，PBS 洗滌后加入二抗，孵育60min，DAB 顯色1～2min，復(fù)染，透明后封片。將切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察并掃描，借助Image J 圖像分析軟件，每張切片隨機(jī)選取10 個(gè)視野（×400），計(jì)算平均光密度值（AOD）[AOD=累積光密度值（IOD）/陽(yáng)性面積（Area）]，代表TGF-β1 和α-SMA 表達(dá)程度。

2.3.5 Western blot 分析 應(yīng)用Western blot 法檢測(cè)大鼠腎組織p-Smad2 和p-Smad3 表達(dá)量。方法：取-80℃留存組織剪碎后，超聲粉碎，加入含有苯甲基磺酰氟（PMSF）的裂解液30min 提取對(duì)應(yīng)蛋白，蛋白存儲(chǔ)于-20℃冰箱。按照BCA 試劑盒步驟在96 孔板中加入試劑，酶標(biāo)儀測(cè)算蛋白含量，用去離子水和5×loading buffer 配置成蛋白總含量為5mg/mL 的樣品，100℃5min 水浴變性。在預(yù)制膠中加入每孔10μL的樣品和預(yù)染marker，電泳100V，1h，轉(zhuǎn)膜220mA，2h，封閉液封閉1.5h，敷一抗4℃搖床110rpm 過(guò)夜，洗膜10min×3 次，敷辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗常溫?fù)u床40rpm 2h，洗膜3 次后，用ECL 顯影劑曝光。運(yùn)用Image J 軟件分析每個(gè)條帶的灰度值，與GAPDH 條帶的比值作為相對(duì)表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)比較 造模后當(dāng)天三組大鼠體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模后第15 天，模型組大鼠體質(zhì)量顯著低于假手術(shù)組（P＜0.05），腎臟質(zhì)量及腎臟指數(shù)均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）；大蒜素組大鼠體質(zhì)量顯著高于模型組（P＜0.05），腎臟指數(shù)顯著低于模型組（P＜0.01），與假手術(shù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

3.2 各組大鼠血SCr、BUN 及24h 尿蛋白比較 干預(yù)結(jié)束后模型組大鼠血SCr、BUN、24h 尿蛋白均顯著高于假手術(shù)組（P 均＜0.01）；大蒜素組大鼠血SCr、BUN 及24h 尿蛋白均低于模型組（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠體質(zhì)量與腎臟指數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量與腎臟指數(shù)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；大蒜素組：大蒜素60mg·kg-1·d-1 灌胃；假手術(shù)組與模型組：等量生理鹽水灌胃

表2 各組大鼠血SCr、BUN 及24h 尿蛋白比較（±s）

表2 各組大鼠血SCr、BUN 及24h 尿蛋白比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；SCr：血清肌酐；BUN：血尿素氮；U-TP：24h 尿蛋白；大蒜素組：大蒜素60mg·kg-1·d-1 灌胃；假手術(shù)組與模型組：等量生理鹽水灌胃

3.3 腎臟病理觀察 使用光學(xué)顯微鏡觀察三組大鼠的Masson 染色切片，假手術(shù)組未見(jiàn)異常，模型組大鼠腎間質(zhì)明顯增寬，部分腎小管擴(kuò)張、萎縮，存在大量藍(lán)色纖維化灶，提示大鼠腎間質(zhì)纖維化模型建立成功；與模型組比較，大蒜素組大鼠腎間質(zhì)紊亂程度較輕，纖維化面積較小。見(jiàn)插頁(yè)圖1。

圖1 大鼠腎組織病理觀察（Masson 染色×200）

3.4 各組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達(dá)量比較 假手術(shù)組大鼠腎組織TGF-β1 與α-SMA 蛋白免疫組化染色僅見(jiàn)少量棕色顆粒沉積，模型組棕色面明顯增大，與模型組比較，大蒜素組陽(yáng)性物質(zhì)沉積相對(duì)減少。半定量法分析顯示，模型組TGF-β1 與α-SMA 蛋白表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01），大蒜素組TGF-β1、α-SMA 量顯著低于模型組（P＜0.01），但高于假手術(shù)組（P 均＜0.01）。見(jiàn)表3、插頁(yè)圖2。

圖2 大鼠腎組織TGF-β1 與α-SMA 表達(dá)（免疫組化DAB 染色×200）

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達(dá)情況比較（±s）

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達(dá)情況比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；α-SMA：α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；大蒜素組：大蒜素60mg·kg-1·d-1 灌胃；假手術(shù)組與模型組：等量生理鹽水灌胃

3.5 各組大鼠腎組織p-Smad2、p-Smad3 蛋白表達(dá)量比較 模型組大鼠腎組織p-Smad2 與p-Smad3蛋白表達(dá)量高于假手術(shù)組（P 均＜0.01），與模型組比較，大蒜素組p-Smad2、p-Smad3 表達(dá)量較低（P 均＜0.01），但高于假手術(shù)組（P 均＜0.01）。見(jiàn)表4、插頁(yè)圖3。

圖3 大鼠腎組織p-Smad2 與p-Smad3 表達(dá)（Western Blot）

表4 各組大鼠腎組織p-Smad2/3 蛋白表達(dá)量比較（±s）

表4 各組大鼠腎組織p-Smad2/3 蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；p-Smad2：磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子2；p-Smad3：磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子3；大蒜素組：大蒜素60mg·kg-1·d-1 灌胃；假手術(shù)組與模型組：等量生理鹽水灌胃

4 討論

腎間質(zhì)纖維化是以過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在腎間質(zhì)積聚、腎臟組織結(jié)構(gòu)破壞、功能喪失為主要特征的病理改變，臨床上根據(jù)纖維化的進(jìn)展程度分為三期，一旦進(jìn)入纖維形成后期或瘢痕形成期，則難以通過(guò)治療逆轉(zhuǎn)。腎纖維化病理涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)、腎臟固有細(xì)胞及免疫細(xì)胞的凋亡、促/抑纖維化細(xì)胞因子失衡等多個(gè)環(huán)節(jié)。研究證明，多種細(xì)胞因子對(duì)該過(guò)程具有調(diào)節(jié)作用，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的積聚，而肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、骨形成蛋白（BMP-7）具有抑制作用[5]。

TGF-β1 的下游靶點(diǎn)涉及MAPKs、Smads、PKA、PKC、Ca2+等通路，以上各因子間相互調(diào)控，構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，其中Smads 蛋白作為中介分子，被認(rèn)為在TGF-β1 信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。研究表明，Smad2/3 參與ECM 合成與降解的相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控：TGF-β1 與TβRⅠ受體結(jié)合后，激活TβRⅡ受體的絲氨酸/蘇氨酸激酶，使Smad2/3磷酸化，p-Smad2/3 與Smad4 形成活性的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物進(jìn)入核內(nèi)，促進(jìn)PAI-1 和Ⅶ膠原基因的表達(dá)，進(jìn)而增加ECM 的合成并減少其降解[6-7]。α-SMA 是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，其含量與組織纖維化程度直接相關(guān)[8]。

大蒜素是大蒜中主要生物活性成分的總稱(chēng)，國(guó)內(nèi)外均有研究證明，大蒜素對(duì)不同致病因素導(dǎo)致的腎損傷具有保護(hù)作用[1-2]。另外，大蒜素能夠?qū)Σ煌K器組織的纖維化起到一定的改善作用。李少春等[9]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大蒜素能夠減少心肌細(xì)胞TGF-β1 和Smad3 表達(dá)，促進(jìn)Smad7 表達(dá)，減輕心肌纖維化的程度；曾玉蘭[4]等研究表明，大蒜素通過(guò)下調(diào)TGF-β1和成纖維細(xì)胞α-SMA 的表達(dá)，從而干預(yù)大鼠肺纖維化的發(fā)生。本研究借助UUO 制備的腎間質(zhì)纖維化大鼠模型，證明大蒜素干預(yù)能夠減輕大鼠的腎間質(zhì)纖維化程度，改善其腎功能，作用機(jī)制可能與降低TGF-β1 在腎組織表達(dá)，抑制Smad2、Smad3 磷酸化，從而減少ECM 的生成相關(guān)。