ARMS法和Sanger測序法檢測晚期肺腺癌小標(biāo)本EGFR基因突變的對比分析

李愛鋒

摘 要：目的：分析ARMS法（amplification refractory mutation system）和Sanger測序法檢測晚期肺腺癌小標(biāo)本EGFR基因突變的效果。方法：選擇濃度相同的人類EBFR基因18、19、20、21號外顯子野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒按照一定比例混合制備成20種標(biāo)準(zhǔn)模板，將其均分為對照組和觀察組，各20例，采用ARMS法檢測小樣本中的EGFR基因突變情況，采用Sanger測序法對EGFR基因18、19、20、21號外顯子野生型及突變型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒多種混合比例樣本進(jìn)行檢測，比較兩種檢測方法的一致性。結(jié)果：對照組與觀察組基因突變率均為100%，兩種檢測方法的一致率為100%。結(jié)論：臨床上采用ARMS法和Sanger測序法檢測晚期肺腺癌小標(biāo)本EGFR基因突變，兩種檢測方法的檢測結(jié)果具有較高的一致性。

關(guān)鍵詞：ARMS法;Sanger測序法;晚期肺腺癌;小標(biāo)本EGFR;基因突變

前言

肺癌的發(fā)病率在逐年上升，但是有研究人員發(fā)現(xiàn)，臨床上有75% 左右的肺癌患者在被確診時就已是局部晚期，部分患者已經(jīng)出現(xiàn)了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，比較常見的一種亞型就是腺癌。在接受全身化療的晚期肺癌中，有大部分患者只需要通過小活檢標(biāo)本或者細(xì)胞學(xué)樣本就能被明確診斷[1]。EGFR基因檢測是臨床上診斷肺癌分子的重要手段，目前應(yīng)用比較廣泛的有ARMS法和Sanger測序法，從理論上發(fā)現(xiàn)，ARMS法較Sanger測序法的特異度和靈敏度均比較高，但是其在小樣本檢測中存在差異的報道比較少。而目前，對于臨床晚期肺癌患者來說，其病理標(biāo)本大多為小組織樣本，因此，對兩種方法檢測晚期肺癌小樣本EGFR基因突變的價值進(jìn)行比較是非常有必要的。本次就對兩種方法檢測晚期肺腺癌患者小樣本EGFR基因突變的效果進(jìn)行詳細(xì)的分析。

1資料與方法

1.1研究對象

選擇濃度相同的人類EBFR基因18、19、20、21號外顯子野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒按照一定比例混合制備成20種標(biāo)準(zhǔn)模板，分為對照組和觀察組，具體如下：

1.2方法

1.2.1采用ARMS法檢測對照組小樣本中的EGFR基因突變情況。使用人類EGFR基因突變檢測試劑盒（蝎形探針ARMS熒光PCR法）therascreen? ? ? EGFR RGQ PCR Kit以及Lightcycler 480進(jìn)行基因檢測。

結(jié)果分析實驗步驟：

（1）參照ABI7500操作手冊進(jìn)行軟件操作。

依據(jù)檢測結(jié)果判斷，報告檢測標(biāo)本有無基因突變。

a.在PCR管冰架上架上滅菌后的八聯(lián)管，將反應(yīng)混合物依次加入八聯(lián)管中，然后小心的蓋上八聯(lián)管管蓋;

b.將加樣后封閉好的八聯(lián)管振蕩混勻，然后離心使液體聚于管底;

c.按下PCR儀上的出艙鍵，將八聯(lián)管放于艙中，然后點擊進(jìn)艙送入熒光定量PCR儀中;

d.儀器顯示正常，然后編輯反應(yīng)程序，選擇Taqman反應(yīng)程序：

（2）在FAM通道，運行外控（Control）Ct值（Cycle threshold，循環(huán)閾值）的計算，Ct值≤34.0，可以繼續(xù)分析。

（3）運行無模板對照（NTC）時，F(xiàn)AM信號無曲線升起，說明實驗無污染存在，可以繼續(xù)分析實驗情況。當(dāng)Ct值≥35.0時，有微弱的擴(kuò)增信號，對實驗的影響極微，可以繼續(xù)分析實驗情況。

（4）運行陽性質(zhì)控品，所有陽性質(zhì)控Ct值一般小于30.0。

（5）在FAM通道中運行Ct的計算，結(jié)果如下：

檢測樣品均曲線呈S型且C≤34.0;陰性對照（NTC）無擴(kuò)增曲線或Ct值≥35.0;陽性對照出現(xiàn)擴(kuò)增曲線且Ct值≤30.0。

依據(jù)檢測結(jié)果判斷，報告檢測樣品均有基因突變。

1.2.2采用Sanger測序法檢測觀察組小樣本中的EGFR基因突變情況。使用4組引物對EGFR外顯子18-21進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用循環(huán)測序試劑盒及ABI3730進(jìn)行正向和反向測序。

對表1 中20種模板采用與EGFR癌基因樣本同樣的引物、反應(yīng)體系及循環(huán)條件進(jìn)行擴(kuò)增測序，樣本采用的是2輪PCR擴(kuò)增，2輪的擴(kuò)增引物相同，具體見表2-表4。

表3? 第一輪的PCR程序如下：

表4? 第二輪的PCR程序如下：

PCR產(chǎn)物電泳產(chǎn)生明顯條帶，才對產(chǎn)物割膠純化后測序，驗證Sanger測序法對突變檢測的靈敏度，對突變型與野生型混合質(zhì)粒系列用Sanger法測序，驗證其對突變的檢測極限，引物是F端和R端引物。進(jìn)行重復(fù)的平行測序。

Sanger測序法對人類EBFR基因18、19、20、21號外顯子野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒按照不同比例混合樣本檢測結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)割膠純化后進(jìn)行測序反應(yīng)，均可檢測出10%比例突變，具體如下：

- EGFR 18號外顯子在10%混合比例時可以檢測出雜合;

- EGFR 19號外顯子在10%混合比例時可以檢測出雜合;

- EGFR 20號外顯子在10%混合比例時可以檢測出雜合;

- EGFR 21號外顯子在10%混合比例時可以檢測出雜合。

1.3觀察指標(biāo)

比較兩種檢測方法的一致性。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P<0.05，表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義為標(biāo)準(zhǔn)，將其中的計量資料用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗，將其中的計數(shù)資料用%表示，用χ2檢驗。

2結(jié)果

2.1對照組EGFR基因檢測結(jié)果

對照組EGFR基因突變率為100%（20/20），野生型0%（0/20），其中外顯子18突變5例，外顯子19突變5例，外顯子20突變5例，外顯子21突變5例。

2.2觀察組EGFR基因檢測結(jié)果。

觀察組EGFR基因突變率為100%（20/20），野生型0%（0/20），其中外顯子18突變5例，外顯子19突變5例，外顯子20突變5例，外顯子21突變5例。

2.3ARMS法和Sanger測序法檢測晚期肺腺癌小標(biāo)本EGFR基因突變的一致性

對20列小標(biāo)本EGFR基因突變情況均采用了ARMS法和Sanger測序法檢測，兩種檢測方法的一致率為100%（20/20），Kappa系數(shù)為1，P<0.05。

3討論

NCCN指南中推薦的根據(jù)是否存在EGFR基因突變實踐對晚期肺腺癌患者的治療進(jìn)行了指導(dǎo)，并且不同的EGFR基因突變類型，其采用靶向治療后的效果也存在著明顯的差異，因此，對肺腺癌患者的EGFR基因突變情況進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測，能夠為臨床治療提供有效的指導(dǎo)依據(jù)[2]。但是臨床上EGFR基因突變的檢測結(jié)果與臨床因素、檢測方法、小樣本因素等有關(guān)[3]。

ARMS法和Sanger測序法是臨床上常用的小標(biāo)本EGFR基因突變檢測方法，前者能夠檢測出組織中0.1%～1%的突變體，而后者對EGFR基因突變細(xì)胞的檢出率為10%～20%[4]。當(dāng)樣本中的DNA難以達(dá)到分光光度法所能夠檢測到最低限度時，小劑量與低比例的腫瘤DNA則會被誤診為EGFR野生型。樣本的選擇對檢測結(jié)果也有著重要的影響，臨床上所使用的標(biāo)本大都是經(jīng)過福爾馬林固定且被包埋于石蠟中，這對標(biāo)本中核酸的完整性造成了破壞。近年來，隨著技術(shù)手段的進(jìn)步，用于EGFR基因突變情況檢測的樣本也逐漸多樣化，如手術(shù)切除、活檢、胸水、外周血等[5]。

本次研究中分別使用了ARMS法和Sanger測序法對20列小標(biāo)本EGFR基因突變檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組與觀察組突變率均為100%（20/20），兩種檢測方法的一致率為100%（20/20）。提示，對于腫瘤細(xì)胞比較少的樣本，就需要使用敏感性比較高的方法進(jìn)行檢測[6、7]。

綜上所述，臨床上采用ARMS法和Sanger測序法檢測晚期肺腺癌小標(biāo)本EGFR基因突變情況，兩種檢測方法具有較高的一致性。但是，對肺腺癌小標(biāo)本組織行ARMS法和Sanger測序法檢測小標(biāo)本EGFR基因突變還存在在這一定的差異性，尤其是采用Sanger測序法檢測晚期肺腺癌小標(biāo)本EGFR基因突變情況時應(yīng)謹(jǐn)慎決定，因為其最低檢測限在10%左右。

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[7]梁繼珍，蘇寧，謝亞琳，et al.ARMS法和Sanger測序法檢測晚期肺腺癌小標(biāo)本EGFR基因突變分析[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2018（1）：2104-2107，2118.