異甘草酸鎂對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠模型的影響

高鈺迪，田 原，張向穎，張曉慧，段鐘平，任 鋒，陳 煜

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，a.疑難肝病及人工肝中心，肝衰竭與人工肝治療研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.北京市肝病研究所，北京 100069

急性肝衰竭是由病毒感染、化學(xué)物質(zhì)損傷及自身免疫反應(yīng)等多種原因引起的嚴(yán)重臨床癥候群，是多種肝臟疾病的終末階段。其起病急、病死率高，內(nèi)科綜合治療效果不佳，外科治療限制因素多，是嚴(yán)峻的全球性健康問(wèn)題，其中肝臟的免疫反應(yīng)是發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵[1]。刀豆蛋白A(ConA)是提取自大刀豆的植物血凝素，同時(shí)具有刺激T淋巴細(xì)胞增殖的特性，其誘導(dǎo)的免疫性肝損傷模型可以較好地模擬病毒性肝炎、自身免疫性肝病等肝臟疾病的免疫學(xué)機(jī)制，是目前應(yīng)用非常普遍的肝病模型之一[2]。異甘草酸鎂(MgIG)是第四代甘草酸類藥物，具有優(yōu)良的抗炎、抗氧化作用，廣泛應(yīng)用于肝病的臨床治療[3-5]。研究[6-7]表明MgIG可通過(guò)調(diào)節(jié)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路緩解多種因素所致肝損傷，而對(duì)ConA誘導(dǎo)免疫性肝損傷的急性肝衰竭模型的作用尚無(wú)較深入研究。本研究通過(guò)MgIG對(duì)ConA誘導(dǎo)急性肝衰竭小鼠模型的影響，進(jìn)一步探究其對(duì)急性肝衰竭發(fā)病機(jī)制中肝臟免疫反應(yīng)可能的保護(hù)機(jī)制，為急性肝衰竭的內(nèi)科臨床診治及新一代甘草酸藥物的臨床應(yīng)用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 健康BALB/C小鼠，雄性，8～12周，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自維通利華生物有限公司，在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院飼養(yǎng)。MgIG藥物由江蘇省正大天晴股份有限公司提供；ConA購(gòu)自美國(guó)西格瑪公司(Sigma)；TUNEL試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏生物制藥公司(Roche)；caspase3活性試劑盒購(gòu)自碧云天生物公司(Beyotime)；預(yù)混液相芯片試劑盒購(gòu)自德國(guó)默克公司(Merck)。

1.2 小鼠免疫性肝損傷模型建立 90只小鼠隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組、MgIG對(duì)照組，每組各10只；ConA模型組、MgIG+ConA預(yù)處理組，每組各35只(其中的15只用來(lái)計(jì)算總生存率)。12 h禁食處理后，對(duì)照組小鼠腹腔注射PBS緩沖液(pH=7.20)處理；MgIG對(duì)照組小鼠采用腹腔注射(30 mg/kg)MgIG[8]；ConA模型組小鼠尾靜脈注射ConA(20 mg/kg)建模；MgIG+ConA預(yù)處理組小鼠于ConA建模前2 h給予MgIG(30 mg/kg)腹腔注射預(yù)處理，根據(jù)轉(zhuǎn)氨酶升高水平判斷建模效果。

1.3 標(biāo)本采集 模型建立后12 h，戊巴比妥鈉麻醉后處死小鼠，取眼球靜脈血1.5 ml，3000 r/min離心10 min獲取上層血清，-80 ℃保存，送檢首都醫(yī)科大學(xué)臨床檢測(cè)中心測(cè)定ALT及AST水平。肝臟組織剪去肝葉邊緣，取5 mm3經(jīng)4%多聚甲醛固定制作石蠟切片待用。取3 mm3于液氮保存制作冰凍切片待用。

1.4 肝臟標(biāo)本HE染色 模型建立后，取肝組織浸泡于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，制備5 μm厚度切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇浸泡，蘇木素及伊紅水溶液染色，光學(xué)顯微鏡以100及200倍數(shù)觀察，并進(jìn)行病理評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)肝細(xì)胞腫脹變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，計(jì)1分；肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，肝細(xì)胞局限性變性、點(diǎn)狀壞死，偶見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，計(jì)2分；肝小葉結(jié)構(gòu)改變，肝細(xì)胞彌散性變性、腫脹、碎片狀壞死，局限性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，計(jì)3分；肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞變性腫脹明顯，亞大塊或大塊壞死，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，計(jì)4分。

1.5 TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡 冰凍切片于4%多聚甲醛中固定30 min，0.1% triton-X 100溶液透化，PBS緩沖液沖洗3次，加入熒光標(biāo)記的TUNEL混合物，DAPI復(fù)染核。熒光顯微鏡下觀測(cè)，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，Image J軟件計(jì)算細(xì)胞數(shù)目。

1.6 caspase3蛋白活性測(cè)定 肝臟組織加入裂解液，冰浴勻漿后離心置于冰上，裂解物4 ℃下18 000×g離心15 min，將上清液移至預(yù)冷離心管中。按試劑盒指導(dǎo)手冊(cè)操作，加入檢測(cè)緩沖液和Ac-DEVD-pNA混勻，37 ℃下孵育2 h，測(cè)定樣品A405，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的蛋白活性。

1.7 蛋白印跡法檢測(cè)caspase3蛋白表達(dá) 肝組織置于1 ml組織裂解液中，電動(dòng)勻漿器勻漿，4 ℃下3000 r/min離心5 min取上清液，-80 ℃儲(chǔ)存。BCA蛋白定量法根據(jù)吸光度計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，30 V電壓下轉(zhuǎn)膜12 h至PVDF膜，5%牛奶封閉，1∶1000第一抗體孵育過(guò)夜；TBST洗膜，1∶2000第二抗體孵育1.5 h。洗膜后加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液曝光。掃描膠片，Image J軟件分析目標(biāo)條帶灰度值。

1.8 液相芯片法測(cè)定小鼠血清炎癥因子 模型建立后，取小鼠外周血以3000 r/min的速度4 ℃下離心10 min，分離上層血清，使用預(yù)混液相芯片試劑盒，按試劑盒指導(dǎo)手冊(cè)操作，Luminex 200系統(tǒng)上機(jī)檢測(cè)。

1.9 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 小鼠生存率 從ConA模型組與MgIG+ConA預(yù)處理組小鼠中各隨機(jī)選取15只，共觀察72 h。ConA模型組小鼠于給藥6 h后開(kāi)始死亡，共死亡9只；MgIG+ConA預(yù)處理組小鼠于給藥12 h后開(kāi)始死亡，共死亡3只。直接概率法計(jì)算ConA模型組小鼠總生存率為40%，MgIG+ConA預(yù)處理組小鼠總生存率為80%(圖1)。

2.2 小鼠ALT和AST水平 ConA模型組小鼠轉(zhuǎn)氨酶水平較對(duì)照組顯著上升(P值均<0.05)，經(jīng)MgIG預(yù)處理小鼠轉(zhuǎn)氨酶水平較ConA模型組小鼠明顯降低(P值均<0.05)(表1)。結(jié)果表明MgIG對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷存在保護(hù)作用。

2.3 小鼠肝臟組織學(xué)變化 模型建立后，根據(jù)建模效果，選取對(duì)照組及MgIG對(duì)照組各8只、ConA模型組與MgIG+ConA預(yù)處理組各12只進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。取肝臟組織經(jīng)HE染色后觀察小鼠肝組織。對(duì)照組小鼠及MgIG對(duì)照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，呈多邊形，圍繞中心靜脈規(guī)則排布圍成肝小葉，肝組織無(wú)淤血。經(jīng)ConA處理12 h后，小鼠肝小葉內(nèi)淤血明顯，肝組織呈大塊及亞大塊壞死，肝細(xì)胞腫脹、排列紊亂，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。MgIG預(yù)處理組較之ConA模型組，肝組織淤血減輕，肝組織壞死區(qū)域明顯減小，僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞形態(tài)大致正常(圖2，3)。對(duì)照組、MgIG對(duì)照組、ConA模型組及MgIG+ConA預(yù)處理組病理評(píng)分分別為1.0±0.2、1.2±0.3、3.7±0.6、2.3±0.5,4組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.7，P<0.05)，對(duì)照組與MgIG對(duì)照組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，余各組間比較結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

表1 各組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平

2.4 小鼠肝組織TUNEL染色 冰凍切片染色后，觀察小鼠肝組織，計(jì)數(shù)胞核深染紅色熒光的細(xì)胞所占比例。對(duì)照組與MgIG對(duì)照組凋亡細(xì)胞較少，凋亡細(xì)胞所占比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ConA模型組小鼠肝細(xì)胞凋亡水平明顯升高，經(jīng)MgIG+ConA預(yù)處理的小鼠肝細(xì)胞凋亡減少，對(duì)照組、MgIG對(duì)照組、ConA模型組及MgIG+ConA預(yù)處理組中每100個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)值分別為0.2±0.1、0.1±0.1、7.8±1.3、2.2±0.4，4組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.6，P<0.001)。對(duì)照組與MgIG對(duì)照組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，余各組間比較結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(圖4)。

2.5 小鼠肝臟caspase-3總蛋白表達(dá)及其活性 肝組織勻漿后采用免疫印跡法檢測(cè)caspase-3總蛋白表達(dá)水平，caspase-3活性試劑盒測(cè)定其蛋白活性。與對(duì)應(yīng)組內(nèi)參β-actin的相對(duì)值比較，4組小鼠caspase-3總蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異。在caspase-3活性檢測(cè)中，對(duì)照組及MgIG對(duì)照組caspase-3活性較低，ConA干預(yù)組小鼠肝組織caspase-3蛋白活性明顯升高，經(jīng)MgIG預(yù)處理后，caspase-3活性較之ConA組下降，對(duì)照組、MgIG對(duì)照組、ConA模型組及MgIG+ConA預(yù)處理組中caspase-3活性分別為0.813±0.022、0.930±0.033、1.347±0.042、1.060±0.053，4組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=51.072，P<0.001)，對(duì)照組與MgIG對(duì)照組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，余各組間比較結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(圖5)。以上數(shù)據(jù)表明MgIG預(yù)處理降低了ConA干預(yù)后肝細(xì)胞凋亡蛋白的活化水平。

2.6 小鼠血清促炎性細(xì)胞因子水平 模型建立后，取小鼠外周血離心分離血清，預(yù)混試劑盒及Luminex 200系統(tǒng)檢測(cè)小鼠血清IL-1β和TNFα表達(dá)水平。結(jié)果表明，對(duì)照組及MgIG對(duì)照組血清促炎性細(xì)胞因子水平較低，ConA建模后小鼠血清中促炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNFα與對(duì)照組比較明顯上升(P值均<0.05)，而MgIG預(yù)處理降低了ConA誘導(dǎo)的促炎性因子水平上升，與ConA模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表2)。結(jié)果表明MgIG可顯著降低ConA誘導(dǎo)的小鼠血清中促炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNFα水平。

表2 4組小鼠血清促炎性細(xì)胞因子水平

3 討論

急性肝衰竭是由多種因素導(dǎo)致的肝臟解毒、合成、排泄及生物轉(zhuǎn)化功能損傷和失代償，是高度兇險(xiǎn)的臨床癥候群，以凝血功能障礙、黃疸、肝性腦病為主要表現(xiàn)，起病急驟，病死率極高。在我國(guó)，急性肝衰竭的主要病因?yàn)椴《拘愿窝?、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病及遺傳代謝性肝病等，肝細(xì)胞病理呈大塊或亞大塊狀壞死，存活肝細(xì)胞嚴(yán)重變性。治療方式以內(nèi)科綜合治療基礎(chǔ)上對(duì)癥治療為主，尚缺乏特效藥物及手段，近年來(lái)人工肝治療及肝移植逐漸應(yīng)用于臨床，但其設(shè)備要求高，肝源稀少限制了急性肝衰竭整體治療效果[1,4]。急性肝衰竭損傷過(guò)程中，肝臟炎癥的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，包括Kupffer細(xì)胞在內(nèi)的大量免疫細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，大量促炎性介質(zhì)引發(fā)的細(xì)胞因子風(fēng)暴介導(dǎo)肝臟內(nèi)的免疫反應(yīng)，加重肝臟炎癥，是促進(jìn)肝細(xì)胞損傷的重要環(huán)節(jié)[9]。細(xì)胞凋亡及壞死是肝衰竭的典型病理表現(xiàn)，Kupffer細(xì)胞等免疫細(xì)胞釋放的TNFα和IL-6可激活STAT3信號(hào)通路并誘導(dǎo)caspase家族蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。IL-1β與TNFα也是損傷肝臟細(xì)胞的重要促炎因子，應(yīng)用抗TNFα抗體可顯著緩解ConA誘導(dǎo)的肝損傷[11]。而ConA具有選擇性刺激T淋巴細(xì)胞增殖作用，誘導(dǎo)肝臟免疫反應(yīng)激活，募集CD4+T淋巴細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞等功能性免疫細(xì)胞聚集于肝門(mén)區(qū)，釋放大量炎癥因子攻擊肝組織，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡、壞死，肝組織受損[2,12-13]。其誘導(dǎo)的免疫性肝損傷可以較好地模擬病毒性肝炎、自身免疫性肝病及肝衰竭病理生理過(guò)程中的肝內(nèi)免疫反應(yīng)。

MgIG是第四代甘草酸類藥物，結(jié)構(gòu)類似糖皮質(zhì)激素，研究[14-16]表明其抗炎、降酶效果好，對(duì)病毒性肝炎、藥物性及酒精性肝病等多種肝臟疾病具有較好療效，可通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK、核因子-кB等炎癥反應(yīng)相關(guān)通路緩解肝臟炎癥。本研究結(jié)果顯示MgIG可顯著降低ConA誘導(dǎo)肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平，減少肝組織壞死，明顯改善肝功能。蛋白印跡結(jié)果及caspase-3活性檢測(cè)共同表明，MgIG可抑制ConA處理后肝組織凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的活化，進(jìn)一步通過(guò)TUNEL染色法證明其減少了肝細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，MgIG可以降低ConA誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的激活，減少肝細(xì)胞凋亡可能是其緩解肝衰竭的機(jī)制之一。

Kupffer細(xì)胞等免疫細(xì)胞及其分泌的多種細(xì)胞因子和血清中炎癥細(xì)胞因子如IL-1β和TNFα與肝衰竭預(yù)后呈正相關(guān)。本研究通過(guò)液相芯片法檢測(cè)小鼠外周血細(xì)胞因子表達(dá)水平，結(jié)果顯示MgIG明顯改善ConA誘導(dǎo)后小鼠血清促炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNFα水平，表明降低促炎性細(xì)胞因子分泌是MgIG緩解肝臟炎癥的可能機(jī)制，并由此緩解ConA誘導(dǎo)的肝損傷。

綜上所述，MgIG可明顯緩解ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝衰竭，其機(jī)制可能為通過(guò)抑制肝細(xì)胞凋亡及降低促炎性細(xì)胞因子分泌水平緩解肝臟炎癥反應(yīng)。本課題組將進(jìn)一步深入研究MgIG對(duì)免疫性肝損傷的保護(hù)作用，探討其對(duì)免疫細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)及其具體的分子機(jī)制。