一株產(chǎn)漆酶菌株的篩選與分離

范美霞　徐傳霞　李俊菊　蔡麗沙　馮慶文

摘 要：產(chǎn)漆酶菌株與焦性沒食子酸反應(yīng)能產(chǎn)生棕褐色的變色圈，根據(jù)這一原理，從土壤中篩選出一株高產(chǎn)漆酶的菌株，并初步研究了溫度對漆酶活性的影響，結(jié)果表明50～60 ℃為其活性最強(qiáng)的溫度范圍。

關(guān)鍵詞：漆酶;Bavendamm培養(yǎng)基;變色圈;真菌

Abstract：Lacese-Produeing microbial stains react with Bavendamm， the response generated with brown， Through this principle， a strain screened from soil strains of high yield of laccase， and a preliminary study of temperature effect on the laccase activity， the results show that between 50～60 ℃ temperature of its most active.

Key words：Laccase; Bavendamms medium; Color changing ring; Fungi

中圖分類號：Q93

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，最早發(fā)現(xiàn)于日本漆樹的傷流液，廣泛存在于昆蟲、植物、真菌和細(xì)菌中[1-4]。漆酶能氧化各種酚類化合物、殺蟲劑等多種環(huán)境污染物，因而被廣泛應(yīng)用于造紙、印染、食品等工業(yè)。也正是因?yàn)槠崦该傅膽?yīng)用價值，故對該酶高產(chǎn)菌的分離篩選成為目前的研究熱點(diǎn)。從現(xiàn)有報道看，漆酶最主要來源于子囊菌和擔(dān)子菌亞門的高等真菌，特別是擔(dān)子菌中的白腐真菌[5]，這些菌也是目前報道最有效的芳香族類化合物的降解菌。但白腐菌一般生長周期長，而且所產(chǎn)漆酶大多為誘導(dǎo)酶[6]，這些特性使工業(yè)生產(chǎn)難以有效進(jìn)行，故篩選生長周期短、產(chǎn)酶時間早的菌株具有十分重要的意義。由于漆酶應(yīng)用廣泛，高酶活菌株的篩選就顯得尤其重要。但目前，對漆酶菌株的篩選尚無簡便可靠的方法，用液體發(fā)酵進(jìn)行初篩既費(fèi)時又費(fèi)力;用木質(zhì)素降解菌的篩選方法，往往針對性較差，效果也不理想。為了尋找漆酶產(chǎn)生菌的初篩條件，筆者根據(jù)不同溫度對漆酶活性的影響，進(jìn)行了漆酶產(chǎn)生菌株初篩條件的研究，結(jié)果大大提高了初篩的工作效率，現(xiàn)將報告如下。

1 實(shí)驗(yàn)原理

Bavendamm平板法是通用的漆酶產(chǎn)生菌初篩方法，其原理是利用菌株分泌的漆酶能使Bavendamm平板中的鞣酸等酚類化合物聚合因而在菌落周圍形成棕褐色輪環(huán)顯色圈的性質(zhì)，根據(jù)顯色圈的直徑大小和產(chǎn)生時間可判斷其產(chǎn)漆酶性能。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)樣品

（1）土壤采樣。采集帶有腐爛楊樹葉的底下

5～15 cm深的土壤，三點(diǎn)采集，每份樣品重約5 g，編號樣品1～7。

（2）從楊木堆中分離篩選。取感染有真菌的木頭，用小刀撬取一小塊接種在選擇培養(yǎng)基平板上，取3份樣品，編號樣品8～10。

2.2 培養(yǎng)基

（1）PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉18 g、KH2PO4 3 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，pH自然（約6.0），加水至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。倒平板后備用。

（2）Bavendamm培養(yǎng)基。馬鈴薯培養(yǎng)基中加入終濃度為0.03%的焦性沒石子酸（鞣酸）。

2.3 試驗(yàn)步驟

2.3.1 產(chǎn)漆酶菌株的初選

（1）在無菌環(huán)境下將樣品1～7研碎，10倍稀釋成不同濃度的樣液。吸取各梯度樣品懸液0.1 mL，均勻涂布于Bavendamm培養(yǎng)基上，每濃度設(shè)2個重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，每24 h觀察一次，選出平板上出現(xiàn)明顯棕褐色變色圈的單菌落菌株，有棕褐色輪環(huán)者記為+，反之記為-，根據(jù)所產(chǎn)褐色圈的大小，選出產(chǎn)漆酶能力強(qiáng)的微生物菌株，并記錄顯色時間[6-8]。

（2）在無菌條件下將樣品8～10研碎，均勻地曬在Bavendamm培養(yǎng)基上，每個樣品設(shè)2個重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，每24 h觀察一次，選平板上出現(xiàn)明顯褐色變色圈的單菌落菌株。記錄菌落周圍有無褐色輪環(huán)產(chǎn)生，有棕褐色輪環(huán)者記為+，反之記為-，根據(jù)所產(chǎn)褐色圈的大小，選出產(chǎn)漆酶能力強(qiáng)的微生物菌株，并記錄顯色時間[6-8]。

2.3.2 產(chǎn)漆酶菌株的復(fù)篩

復(fù)篩漆酶活性的檢測可根據(jù)Bavendamm的方法進(jìn)行，由于培養(yǎng)基中加入一定量的愈創(chuàng)木酚，含有漆酶的菌株在這特定培養(yǎng)基上長出的菌絲能產(chǎn)生明顯的橘紅色。用Bavendamm方法能判斷菌株有無漆酶，而且根據(jù)變色圈顏色深淺能大致分析出試驗(yàn)菌株含有漆酶活力高低。對培養(yǎng)過程中每天變色圈和菌絲圈尺寸大小和變色圈顏色深淺變化進(jìn)行分析，篩選出1株產(chǎn)漆酶較高的菌株，編號為菌株1，此菌株作為進(jìn)一步研究的試驗(yàn)菌株。

挑選出現(xiàn)棕褐色變色圈的單菌落進(jìn)行打孔，使用直徑5 mm的打孔器。將打孔下來的菌片接種到PDA培養(yǎng)基上的菌株置于28 ℃的恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待菌落長到直徑5 cm左右進(jìn)行打孔轉(zhuǎn)接。

2.3.3 產(chǎn)漆酶菌株的鑒定

將上步的菌株打孔轉(zhuǎn)接到馬鈴薯培養(yǎng)基上，至于28 ℃恒溫培養(yǎng)。在打孔過的平板的孔隙內(nèi)加入0.1%的焦性沒食子酸溶液，置于28 ℃恒溫箱中，每12 h觀察平板底部顏色的變化。將棕褐色變化最深的菌株打孔10份，編號為1-1、1-2、2-1、2-2、3-1、3-2、4-1、4-2，5-1，5-2，接種到馬鈴薯培養(yǎng)基上。置于28 ℃中培養(yǎng)。然后挑取在PDA平板上的菌絲制成菌懸液，于顯微鏡下觀察其菌絲形態(tài)。

2.3.4 產(chǎn)漆酶速度的鑒定

待菌落的直徑長到5 cm左右時，對培養(yǎng)基打孔，在打孔的培養(yǎng)基的孔隙中滴入4滴0.1%的焦性沒食子酸溶液，分別放入28、37、50、60 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔30 min進(jìn)行觀察。尋找最先出現(xiàn)棕褐色變化的樣品，并記錄產(chǎn)生棕褐色的時間。

3 結(jié)果與分析

3.1 初篩結(jié)果

在10個采集的試驗(yàn)樣品中，有3個樣品疑似含有產(chǎn)漆酶菌株，并且菌落的大小都不相同，菌落的顏色為棕紅色，對疑似區(qū)域用小號打孔器進(jìn)行打孔轉(zhuǎn)接到馬鈴薯培養(yǎng)基上。對采集的樣品培養(yǎng)72 h后觀察結(jié)果如表l表示，變色圈形態(tài)如圖1所示。

3.2 復(fù)篩結(jié)果

將打孔的菌落接種在馬鈴薯培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)后72 h較大的單菌落，對菌落打孔轉(zhuǎn)接后置于28 ℃中，在孔隙中加入4滴0.1%的焦性沒食子酸溶液，24 h觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)有3株菌落有棕褐色變化，并且顏色變化不同，結(jié)果如圖2所示。

3.3 漆酶菌株的形態(tài)鑒定

經(jīng)顯微鏡檢測，該菌菌絲體為絲狀，具有隔膜，有鎖狀聯(lián)合，細(xì)胞為多核結(jié)構(gòu)，符合漆酶的特征（圖略）。

3.4 產(chǎn)漆酶菌株的快速篩選

將培養(yǎng)的平板打孔，每個孔隙中加入4滴0.1%焦性沒食子酸溶液，分別置于28、37、50、60 ℃的環(huán)境中恒溫培養(yǎng)，每間隔30 min觀察一次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50 ℃最先出現(xiàn)顏色變化，其次是60 ℃，最后是37 ℃和28 ℃。表明漆酶的最適溫度在50～60 ℃。在50 ℃反應(yīng)4 h，結(jié)果如圖3所示。

4 結(jié)論

通過平板顯色法從土壤中篩選出一株高產(chǎn)漆酶的菌株，并初步研究了溫度對漆酶活性的影響，初步測得該菌株所分泌的漆酶發(fā)揮活性的最適溫度在50～60 ℃，對于該酶有關(guān)理化性質(zhì)還在進(jìn)一步的研究中。

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