芪蛭三七湯對(duì)心肌梗死大鼠心室重構(gòu)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡的影響*

蘇學(xué)旭，仲秀艷

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.心病內(nèi)科，2.腦病內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550001）

心血管疾病是威脅我國(guó)國(guó)民生命健康的最主要的公共衛(wèi)生安全問(wèn)題，尤其是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ㄒ韵潞?jiǎn)稱(chēng)冠心?。┑陌l(fā)病率逐年上升，大大增加社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)。心肌梗死（myocardial infarction,MI）屬于冠心病的危急重癥之一，在血流動(dòng)力學(xué)、神經(jīng)體液等因素綜合影響下，MI患者的心臟易發(fā)生結(jié)構(gòu)重構(gòu)、功能重構(gòu)和電重構(gòu)[1]。其最初表現(xiàn)為左心室?guī)缀涡螤罴敖Y(jié)構(gòu)改變，并伴有心肌細(xì)胞肥大、心肌代償性肥厚，最終發(fā)生心力衰竭[2]。因此心室重構(gòu)是MI進(jìn)展式演變的主要病理機(jī)制之一，是患者致死和致殘的主要原因[3]。如何改善MI后心室重構(gòu)、降低心力衰竭的發(fā)生率是MI二級(jí)預(yù)防亟待解決的重大難題。心肌缺血可觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress,ERS），適當(dāng)?shù)腅RS可反饋性保護(hù)心肌缺血損傷，但是若心肌細(xì)胞長(zhǎng)期存在嚴(yán)重的ERS，則可能會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡[4]。近年來(lái)，許多自擬方逐漸用于治療心力衰竭，并取得良好的臨床療效[5]。但是由于作用機(jī)制不明確，限制了中藥制劑在臨床上的應(yīng)用。芪蛭三七湯是由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院多個(gè)科室成員基于多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)共同研制完成，主要成分包括黃芪、桂枝、水蛭、三七和冰片。芪蛭三七湯已應(yīng)用于臨床，前期已有研究證實(shí)其療效顯著且安全可靠[6]。筆者通過(guò)對(duì)該經(jīng)驗(yàn)方的不斷完善，固定藥物劑量、精確工藝流程，擬通過(guò)本項(xiàng)研究在動(dòng)物和細(xì)胞水平闡述芪蛭三七湯改善MI大鼠心室重構(gòu)的分子機(jī)制，為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療MI的研究提供新的思路。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑與儀器

芪蛭三七湯由本院藥劑科根據(jù)中醫(yī)理論自行配制。配方為：黃芪 30 g，水蛭 10 g，三七 10 g，桂枝10 g，冰片0.1 g。水煎內(nèi)服，濃縮至相當(dāng)于原生藥材0.63 g/ml。

羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78（glucose regulated protein 78,GRP78）抗體、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PRKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK） 抗 體、p-PERK抗體、真核細(xì)胞翻譯起始因子2α（eukaryotictranslation initiation factor 2α,eIF2α） 抗 體、p-eIF2α 抗體及活化轉(zhuǎn)錄因子 4（activating transcription factor 4,ATF 4）抗體（美國(guó)Abcam公司），B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）抗體、Bcl-2 相關(guān) X 蛋白（bcl-2-associated X protein,Bax）抗體及 Caspase-3 抗體（美國(guó) R & D Systems公司），RIPA 加強(qiáng)型細(xì)胞裂解液（美國(guó)Solarbio公司），3%戊巴比妥鈉由本院藥劑科提供，PCR引物由蘇州Genewiz生物科技有限公司合成并提供，BCA定量試劑盒、TUNEL試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），cDNA合成試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒及Taq DNA聚合酶（美國(guó)Omega公司），實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其余所用試劑均為分析純。

小動(dòng)物呼吸機(jī)（DW2000，上海嘉鵬科技有限公司），石蠟切片機(jī)（HM 340E，美國(guó)Thermo公司），PowerLab數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)（澳大利亞AD instruments公司），實(shí)時(shí)定量PCR儀和iMake全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司），CX41光學(xué)倒置顯微鏡、熒光共聚焦顯微鏡及JEM-1400型透射電子顯微鏡（日本Olympus公司），F(xiàn)luor Chem FC3 凝膠成像數(shù)碼分析系統(tǒng)（美國(guó) Protein Simple公司）。

1.2 模型的復(fù)制、分組及干預(yù)方式

70只健康雄性SD大鼠，體重220～250 g，無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)，購(gòu)自上海睿太莫斯生物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2016-0001，飼以無(wú)菌顆粒飼料，自由飲水；動(dòng)物房溫度穩(wěn)定在（25±1）℃，相對(duì)濕度為40%～70%，12 h晝/夜交替照明。所有操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法復(fù)制MI大鼠模型[7]。復(fù)制模型前，大鼠禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥40 ml/kg，將大鼠置于自制的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上，固定四肢?？v向剖開(kāi)氣管，插入小動(dòng)物呼吸機(jī)，頻率維持70次/min，潮氣量為1.5～2.0 ml/100 g。術(shù)前描述Ⅱ?qū)?lián)心電圖。在胸骨左緣3～4肋骨間開(kāi)胸，充分暴露心臟。揭開(kāi)心包膜和脂肪墊，暴露左心耳后，對(duì)兩組MI模型大鼠，采用7號(hào)縫合線在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳之間左冠狀動(dòng)脈前降支處進(jìn)行結(jié)扎，造成心肌缺血；而對(duì)假手術(shù)組大鼠，并未對(duì)冠狀動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎，直接縫合關(guān)胸。采用心電圖監(jiān)測(cè)S-T段出現(xiàn)弓背樣抬高（＞0.2 mV）或T波高聳，肉眼見(jiàn)結(jié)扎周?chē)募〗M織呈暗紅色或灰白色，則顯示進(jìn)行性心肌梗死模型復(fù)制成功。成功后大鼠自由活動(dòng)和進(jìn)食。

取模型復(fù)制成功大鼠，稱(chēng)重，按照隨機(jī)數(shù)字表法分組，分組及干預(yù)方式如下：①空白對(duì)照組（n =15）：灌胃給予10 ml/（kg·d）無(wú)菌生理鹽水。②假手術(shù)對(duì)照組（假手術(shù)組）（n =14）：灌胃給予 10 ml/（kg·d）無(wú)菌生理鹽水。③MI模型對(duì)照組（MI組）（n =11）：灌胃給予10 ml/（kg·d）無(wú)菌生理鹽水。④芪蛭三七湯干預(yù)模型組（QZ組）（n =13）：灌胃給予22.68 g/（kg·d）（相當(dāng)于2倍臨床等效劑量）芪蛭三七湯溶液。于模型復(fù)制后次日開(kāi)始給藥，1次/d，連續(xù)給藥4周。

1.3 超聲心動(dòng)圖

術(shù)后4周，稱(chēng)量大鼠體重，大鼠吸入乙醚麻醉后，置于自制的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上，固定四肢。采用小動(dòng)物超聲儀獲取乳頭肌水平短軸切面，每組數(shù)據(jù)測(cè)量3次，取平均值。檢測(cè)左室舒張末徑（left ventricular enddiastolic dimension,LVEDd）、 左 室 收 縮 末 徑（left ventricular end-systolic dimension,LVESd）、左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction,LVEF）、左心室短軸縮短率（fractional shortening,FS）。

1.4 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)

心功能檢測(cè)完畢后，分離大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈，插入PE-50聚乙烯導(dǎo)管，連接PowerLab數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)，記錄平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure,MAP），進(jìn)一步插入左心室，記錄左室壓上升最大速率（+dp/dtmax）和左室壓下降最大速率（-dp/dtmax）。每組數(shù)據(jù)測(cè)量3次，取平均值。

1.5 心肌梗死面積

將大鼠頸椎脫臼處死后，迅速取出心臟，放入預(yù)冷的生理鹽水中，灌洗心臟，從主動(dòng)脈逆行注射伊文斯蘭，分離心房和心室，將心室置于含有2%瓊脂糖的培養(yǎng)皿中固定，切片后，避光置于復(fù)溫的、含有2%TTC磷酸緩沖液的棕色小瓶中孵育30 min。此時(shí)梗死區(qū)為灰白色，可判斷梗死心肌面積（area of necrosis,AN）；磚紅色為缺血非梗死區(qū)；而缺血區(qū)面積（area at risk,AAR）為灰白色和磚紅色之間的顏色區(qū)域；正常區(qū)域?yàn)樗{(lán)色。將心臟組織置于4%多聚甲醛，采用Sigma Scan軟件計(jì)算梗死區(qū)域面積。梗死范圍以AN/AAR表示。每組數(shù)據(jù)測(cè)量3次，取平均值。

1.6 標(biāo)本采集及處理

1.6.1 標(biāo)本采集取出大鼠心臟后，取出心房和右心室，于結(jié)扎點(diǎn)下橫切2～3 mm，置于4%多聚甲醛溶液中固定5～7 d。然后生理鹽水清洗固定液，分別在60%、75%和90%的乙醇溶液中浸泡30 min，然后在100%乙醇Ⅰ中浸泡10 min，后在100%乙醇Ⅱ中浸泡20 min。采用石蠟包埋，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 HE染色 取心肌組織石蠟包埋塊，組織切片（3～4 μm），進(jìn)行HE染色。首先將組織切片脫蠟，采用100%、90%、75%乙醇梯度脫水，滴加蘇木精染色5 min，沖洗3 s，滴加1%鹽酸乙醇分化，沖洗，滴加0.5%伊紅染色液染色3 min，沖洗，采用75%、90%、100%乙醇脫水，滴加松節(jié)油透明，中性樹(shù)膠封片。置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6.3 心肌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)取石蠟包埋塊，切片（3～4 μm）。采用TUNEL法，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。每張切片于非梗死區(qū)域隨機(jī)選擇10個(gè)高倍鏡視野（×40），計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色細(xì)胞比例，比（%）表示凋亡指數(shù)（apoptosis index,AI）。每組數(shù)據(jù)測(cè)量 3 次，取平均值。

1.7 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

①蛋白提?。喝〗Y(jié)扎線下左室后壁心肌組織約100 mg，加入預(yù)冷PBS，清洗3次；將組織剪碎后，加入1 ml預(yù)冷的蛋白裂解液，冰浴30 min，勻漿；離心，取上清液；采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行下一步操作。②蛋白變性：加入SDS上樣緩沖液充分混勻，置于95℃水浴中10 min，使蛋白變性，分裝，置于-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。③Western blotting：將10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。將PVDF浸入密封液中，室溫密閉1 h。取出PVDF，采用TBST沖洗3次，分別加入GRP-78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4抗體（1∶500稀釋?zhuān)┗蛘叩蛲鱿嚓P(guān)蛋白抗體Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cytochrome C（1 ∶ 1 000 稀釋?zhuān)?，置?℃搖床上過(guò)夜。采用TBST沖洗3次，加入二抗，37℃孵育1 h，采用TBST沖洗3次；取適量的ECL試劑顯影5 min，采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析凝膠光密度值。每組數(shù)據(jù)測(cè)量3次，取平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物存活狀態(tài)

由于麻醉、操作失誤、氣胸以及術(shù)后24 h內(nèi)因死亡15只，術(shù)后24 h存活率為72.73%。假手術(shù)大鼠死亡1只，MI大鼠死亡14只，因此給藥前，假手術(shù)組有14只大鼠，MI組和QZ組各13只大鼠。給藥期間，QZ組、空白對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠無(wú)死亡，而MI組于術(shù)后第10天和16天各死亡1只。

2.2 大鼠MI后心臟結(jié)構(gòu)和功能變化

2.2.1 超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)術(shù)后4周，各組大鼠 LVEDd、LVESd、LVEF、FS水平比較，采用單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠比較，MI組大鼠LVEF和FS降低（P＜0.05），而 LVEDd、LVESd增加（P＜0.05），左室前壁變?。≒＜0.05）；但是與MI組大鼠比較，QZ組大鼠LVEF和FS均升高（P＜0.05），而LVEDd和LVESd均降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1和圖1。

2.2.2 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)術(shù)后4周，各組大鼠 +dp/dtmax和-dp/dtmax比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠比較，MI組大鼠 +dp/dtmax和 -dp/dtmax絕對(duì)值降低（P＜0.05）。但是與MI組大鼠比較，QZ組大鼠+dp/dtmax和-dp/dtmax絕對(duì)值升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.2.3 梗死范圍比較術(shù)后4周，空白對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠無(wú)梗死區(qū)域。MI組大鼠梗死范圍為（76.85±12.36）%，QZ組大鼠梗死范圍為（28.13±10.06）%，QZ組大鼠梗死范圍少于MI組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =10.652，P =0.000）。

表1 各組大鼠心功能情況（±s）

表1 各組大鼠心功能情況（±s）

注：①與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；②與假手術(shù)組比較，P＜0.05；③與MI組比較，P＜0.05。

組別 n LVEDd/mm LVESd/mm LVEF/% FS/%空白對(duì)照組 15 7.51±0.44 3.54±0.32 83.36±1.37 53.92±1.45假手術(shù)組 14 7.49±0.50 3.51±0.28 84.05±1.72 54.43±1.80 MI組 11 10.35±0.79①② 9.06±0.65①② 30.75±8.58①② 15.78±8.69①②QZ組 13 8.76±0.71①②③ 7.12±0.58①②③ 67.86±10.93①②③ 38.54±11.56①②③F值 59.950 436.631 163.528 80.681 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 各組超聲心動(dòng)圖

表2 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（mmHg/s，±s）

表2 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（mmHg/s，±s）

注：①與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；②與假手術(shù)組比較，P＜0.05；③與 MI組比較，P＜0.05。

組別 n +dp/dtmax -dp/dtmax空白對(duì)照組 15 3 735.44±474.58 -3 037.51±379.45假手術(shù)組 14 3 811.86±512.79 -3 126.62±400.53 MI組 11 1 640.75±384.80①② -1 258.06±297.35①②QZ 組 13 3 023.26±435.86①②③ -2 485.13±447.39①②③F值 57.761 58.884 P值 0.000 0.000

2.2.4 心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化解剖各組大鼠心臟，空白對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠心臟幾何形狀規(guī)整，心臟體積和心腔大小正常，顏色呈鮮紅色，彈性和韌性良好。與空白對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠比較，MI組大鼠心肌組織失去原有的幾何形狀，體積增大，呈普大型；心腔擴(kuò)大，呈暗紅色；彈性和韌性降低。另外，QZ組大鼠心臟也出現(xiàn)增大情況，顏色較假手術(shù)組偏深偏暗，但是與MI組大鼠比較，情況好轉(zhuǎn)。幾何形狀相對(duì)規(guī)整，彈性和韌性尚可。見(jiàn)圖2。

經(jīng)HE染色后，光鏡下觀察可見(jiàn)空白對(duì)照組和假手術(shù)組心肌細(xì)胞呈多層整齊緊密排列，無(wú)水腫、壞死情況，心肌纖維排列緊密，呈束狀，橫紋肌清晰可見(jiàn)，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。MI組可見(jiàn)心肌纖維腫脹、排列紊亂，甚至部分?jǐn)嗔选⑷芙?、消失，胞漿疏松，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而QZ組大鼠心肌組織雖然也出現(xiàn)肌纖維腫脹、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，但是較MI組減輕。見(jiàn)圖2。

2.2.5 心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化經(jīng)透射電鏡觀察左室梗死周邊區(qū)心肌超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較，MI組和QZ組MI周邊區(qū)有明顯的肌節(jié)長(zhǎng)短不齊、肌絲斷裂溶解，線粒體的腫脹、空泡化，線粒體嵴減少改變。而QZ組未見(jiàn)肌絲斷裂，線粒體略腫脹，但結(jié)構(gòu)基本正常，線粒體嵴可見(jiàn)，并能見(jiàn)到線粒體堆積和代償性增多現(xiàn)象。見(jiàn)圖3。

2.3 大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況

2.3.1 各組大鼠非梗死區(qū)心肌AI情況 各組大鼠非梗死區(qū)心肌AI比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較，MI組大鼠非梗死區(qū)心肌AI較高（P＜0.05）。QZ組大鼠非梗死區(qū)心肌AI低于MI組大鼠（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.3.2 各組大鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)情況各組大鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)量比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？瞻讓?duì)照組和假手術(shù)組大鼠心肌組織Bcl-2、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。與空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較，MI組大鼠心肌組織Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量升高，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）。與MI組大鼠比較，QZ組大鼠心肌組織Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05）。見(jiàn)表3和圖4。

2.4 大鼠心肌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-eIF2α信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.4.1 各組大鼠心肌組織GRP78 蛋白表達(dá)情況 各組大鼠GRP78蛋白表達(dá)量比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較，MI組大鼠心肌組織GRP78蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05）。與MI組大鼠比較，QZ組大鼠心肌組織GRP78蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）。見(jiàn)表4和圖5。

2.4.2 各組大鼠心肌組織PERK、eIF2α蛋白表達(dá)及磷酸化水平 各組大鼠心肌組織PERK和eIF2α蛋白表達(dá)量基本一致，采用單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），但p-PERK 和p-eIF2α 蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較，MI組大鼠心肌組織p-PERK和p-eIF2α蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05）。與MI組大鼠比較，QZ組大鼠心肌組織p-PERK和p-eIF2α蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）。見(jiàn)表4和圖5。

2.4.3 各組大鼠心肌組織ATF4 蛋白表達(dá)情況 各組大鼠ATF4蛋白表達(dá)量比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較，MI組大鼠心肌組織ATF4蛋白表達(dá)量較高（P＜0.05）。與MI組大鼠比較，QZ組大鼠心肌組織ATF4蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）。見(jiàn)表4和圖5。

圖2 各組大鼠心肌組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)

圖3 各組大鼠心肌組織的超微結(jié)構(gòu)（×20 000）

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況（±s）

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況（±s）

注：①與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；②與假手術(shù)組比較，P＜0.05；③與MI組比較，P＜0.05。

組別 n AI/% Caspase-3 Bcl-2 Bax空白對(duì)照組 15 7.84±3.19 0.65±0.15 1.28±0.17 0.52±0.12假手術(shù)組 14 9.55±4.32 0.67±0.12 1.21±0.18 0.49±0.11 MI組 11 49.35±14.67①② 1.36±0.34①② 1.10±0.28①② 0.72±0.23①②QZ組 13 23.96±11.78①②③ 0.89±0.28①②③ 1.26±0.12①②③ 0.56±0.09①②③F值 56.041 26.691 7.593 80.681 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖4 各組心肌細(xì)胞凋亡情況

表4 各組大鼠GRP78、p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4蛋白表達(dá)量的比較（±s）

表4 各組大鼠GRP78、p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4蛋白表達(dá)量的比較（±s）

注：①與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；②與假手術(shù)組比較，P＜0.05；③與MI組比較，P＜0.05。

組別 n GRP78 p-PERK PERK p-eIF2α eIF2α ATF4空白對(duì)照組 15 0.75±0.09 0.36±0.09 1.26±0.17 0.28±0.07 0.77±0.12 0.52±0.09假手術(shù)組 14 0.74±0.12 0.37±0.10 1.28±0.20 0.27±0.04 0.72±0.10 0.50±0.12 MI組 11 1.51±0.28①② 0.56±0.15①② 1.24±0.18 0.47±0.06①② 0.77±0.15 1.05±0.16①②QZ組 13 1.13±0.21①②③ 0.44±0.10①②③ 1.21±0.18 0.35±0.05①② 0.76±0.06 0.63±0.15①②③F值 50.249 8.582 0.361 32.357 0.633 46.110 P值 0.000 0.000 0.783 0.000 0.596 0.000

圖5 各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-eIF2α信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

3 討論

心室重構(gòu)是MI發(fā)展為心力衰竭的基本病理過(guò)程。MI患者心臟因血流動(dòng)力學(xué)改變、神經(jīng)體液因素影響等，易發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能重構(gòu)。臨床多表現(xiàn)為梗死區(qū)形成膠原瘢痕伴膨脹，肺梗死區(qū)域出現(xiàn)心肌肥厚、心室擴(kuò)張以及心功能損傷等，是患者致死和致殘的主要原因[8]。在我國(guó)，MI后心室重構(gòu)的發(fā)生率約為30%～50%[9]，進(jìn)入本世紀(jì)以來(lái)，隨著再灌注治療的大力推廣和普及，大大降低MI患者的病死率，但是促使更多的MI患者進(jìn)入心肌梗死后心室重構(gòu)的階段。因此，如何減緩或逆轉(zhuǎn)MI后心室重構(gòu)，降低心力衰竭的發(fā)生率，一直是心血管領(lǐng)域亟待解決的難題。

MI后心室重構(gòu)在細(xì)胞水平的病理變化包括心肌細(xì)胞病理性肥大、心肌細(xì)胞凋亡或壞死、細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積等[10]。本項(xiàng)研究中，筆者通過(guò)結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支造成心肌缺血性壞死，通過(guò)顯微鏡下組織形態(tài)觀察，MI模型組大鼠心肌組織失去原有的幾何形狀，體積增大，呈普大型；心腔擴(kuò)大，呈暗紅色；彈性和韌性降低；心功能下降。經(jīng)HE染色后，MI組大鼠心肌纖維腫脹、排列紊亂，甚至部分?jǐn)嗔?、溶解、消失，胞漿疏松，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。除此以外，經(jīng)伊文思藍(lán)和TTC雙染法證實(shí)MI大鼠心肌組織出現(xiàn)大面積梗死，且持續(xù)心肌缺血導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死和凋亡，心肌結(jié)構(gòu)和心室構(gòu)型同時(shí)發(fā)生相應(yīng)變化，損傷心肌收縮-舒張功能，造成血流動(dòng)力學(xué)障礙。主要表現(xiàn)為+dp/dtmax降低，-dp/dtmax升高，室壁順應(yīng)性下降。從而從組織、細(xì)胞、分子水平多方面證實(shí)MI模型大鼠復(fù)制成功。而上述MI組大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生的一系列變化經(jīng)芪蛭三七湯干預(yù)4周后均有所改善。

近幾年本院在MI的病因病機(jī)、治則治法及復(fù)方組成研制等方面均取得突破性進(jìn)展。其中芪蛭三七湯是本科室基于多年臨床經(jīng)驗(yàn)、結(jié)合中西醫(yī)理論總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，且已用于臨床，并得到患者的普遍認(rèn)可。該湯藥是由黃芪、桂枝、水蛭、三七、冰片組成。該方以黃芪和三七為君藥，可益氣以助血行，貫心脈而養(yǎng)五臟[11]。桂枝、水蛭為臣藥，既能夠益氣養(yǎng)陰，又可解毒化瘀，水蛭破瘀通絡(luò)臣，桂枝溫陽(yáng)通脈，冰片開(kāi)通心竅，引藥入絡(luò)為佐使，諸藥合參，共收益氣活血、破瘀通絡(luò)之功效，體現(xiàn)了以補(bǔ)為通，以通為補(bǔ)，通補(bǔ)兼施的特點(diǎn)。因此，在本項(xiàng)研究中，芪蛭三七湯可改善MI大鼠模型的心臟功能，但是其具體的作用成分和作用機(jī)制尚不明確。近幾年筆者通過(guò)對(duì)該方劑的不斷完善，固定藥物劑量、精準(zhǔn)生產(chǎn)流程，最終獲得本實(shí)驗(yàn)所用的芪蛭三七湯劑，筆者擬通過(guò)動(dòng)物、細(xì)胞、分子水平探討中藥復(fù)方制劑芪蛭三七湯用于心肌梗死后心室重構(gòu)的干預(yù)作用以及作用機(jī)制，為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)闡釋MI后心室重構(gòu)發(fā)生機(jī)制的研究以及藥物研發(fā)提供新的思路。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞儲(chǔ)存鈣離子、折疊修飾蛋白或脂質(zhì)類(lèi)物質(zhì)的重要場(chǎng)所[12]。心肌梗死患者因心肌細(xì)胞發(fā)生缺血、缺氧性壞死，易導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白及錯(cuò)誤折疊蛋白大量聚集以及鈣離子失衡，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑[13]。在本研究中，經(jīng)TUNEL法顯示，空白對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠非梗死區(qū)心肌AI基本一致，MI組大鼠非梗死區(qū)心肌AI較空白對(duì)照組和假手術(shù)組有所升高，而經(jīng)芪蛭三七湯干預(yù)后，大鼠非梗死區(qū)心肌AI低于MI組大鼠。筆者又進(jìn)一步采用Western blotting法檢測(cè)各組大鼠心肌組織凋亡蛋白和促凋亡蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，芪蛭三七湯可有效抑制MI大鼠周邊梗死區(qū)域細(xì)胞凋亡指數(shù)，同時(shí)降低心肌組織中促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)，提高抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量，可見(jiàn)芪蛭三七湯干預(yù)MI后心室重構(gòu)的機(jī)制與抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

未折疊蛋白反應(yīng)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的一系列自我保護(hù)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，對(duì)修復(fù)細(xì)胞損傷、清理壞死細(xì)胞、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性十分重要[14]。靜息狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白通過(guò)與分子伴侶GRP78蛋白相結(jié)合而長(zhǎng)期處于未激活狀態(tài)。GRP78蛋白屬于熱休克蛋白70家族成員之一，與蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊、降解密切相關(guān)，其基因啟動(dòng)子上含有特異性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)原件，正常情況下，可與PERK、ATF6、IRE1 3種跨膜蛋白相結(jié)合[15]。若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白折疊失敗而大量滯留，GRP78與這3種跨膜蛋白相解離，使其激活并觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)。因此GRP78激活通常被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生的標(biāo)志[16]。在本項(xiàng)研究中，空白對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠心肌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78蛋白表達(dá)量基本一致，MI組大鼠心肌組織GRP78蛋白表達(dá)量高于空白對(duì)照組和假手術(shù)組；QZ組大鼠心肌組織GRP78蛋白表達(dá)量較MI組大鼠有所降低。提示芪蛭三七湯保護(hù)心肌細(xì)胞的分子機(jī)制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。靜息狀態(tài)下，細(xì)胞中GRP78與PERK、ATF6、IRE1 3種蛋白結(jié)合處于未激活狀態(tài)，若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上聚集大量未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白，發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，則可能引起PERK-eIF2α信號(hào)通路的激活[17]。PERK的主要作用是抑制錯(cuò)誤折疊蛋白的合成和翻譯，發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，PERK脫離GRP78，促使eIF2α發(fā)生磷酸化，從而抑制其蛋白功能[18]。而磷酸化的eIF2α可促使ATF4發(fā)生轉(zhuǎn)錄翻譯，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19]。在本項(xiàng)研究中，4組大鼠心肌組織PERK和eIF2α蛋白表達(dá)量基本一致，但與空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較，MI組大鼠心肌組織p-PERK和p-eIF2α蛋白表達(dá)量有所升高，而經(jīng)芪蛭三七湯干預(yù)后，大鼠心肌組織p-PERK和p-eIF2α蛋白表達(dá)量有所降低。說(shuō)明MI后，大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)PERK含量并未增加，但是具有活性的p-PERK水平升高，p-PERK可促使eIF2α蛋白發(fā)生磷酸化。PERK-eIF2α通路進(jìn)一步激活下游因子ATF-4促凋亡蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由此推測(cè)在MI伴心室重構(gòu)過(guò)程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激尤其是PERK-eIF2α信號(hào)通路的高度活化，對(duì)心肌細(xì)胞具有嚴(yán)重?fù)p傷作用[20]。而芪蛭三七湯通過(guò)降低具有活性作用的p-PERK和p-eIF2α的表達(dá)水平，抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

綜上所述，芪蛭三七湯經(jīng)驗(yàn)方可有效改善MI后大鼠的心功能，減輕不利的心室重塑。而其核心機(jī)制可能與抑制PERK-eIF2α信號(hào)通路誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡有關(guān)。