茶葉中茶多酚和生物堿的測(cè)定及聚類和線性判別分析

肖俊松，袁英髦，張愛雪，曹雁平,*

(1.北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100048；2.食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

茶葉中茶多酚和生物堿的測(cè)定及聚類和線性判別分析

肖俊松1,2，袁英髦1，張愛雪1，曹雁平1,2,*

(1.北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100048；2.食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

目的：建立一種反相高效液相色譜方法，測(cè)定綠茶、烏龍茶、紅茶、白茶和普洱茶中兒茶素[(+)-catechin，C]、表兒茶素[(-)-epicatechin，EC]、表兒茶素沒食子酸脂[(-)-epicatechin gallate，ECG]、表沒食子兒茶素[(-)-epigallocatechin，EGC]、表沒食子兒茶素沒食子酸脂[(-)-epigallocatechin gallate，EGCG]、沒食子酸(gallic acid，GA)、咖啡因(caffeine，CAF)、可可堿(theobromine，THEO)的水平。以這8種組分為指標(biāo)對(duì)茶葉進(jìn)行聚類分析和線性判別分析，建立區(qū)分綠茶、紅茶和烏龍茶的方法。方法：茶葉提取后采用HPLC法測(cè)定兒茶素和生物堿含量，色譜柱為C18柱，流動(dòng)相由甲醇(A)、2%的乙酸(B)等度洗脫，A、B相的體積比為25:75，流速為1mL/min，柱溫30℃。采用PDA檢測(cè)器在278nm檢測(cè)，參考波長(zhǎng)為210nm。采用SPSS 14.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了聚類分析和線性判別分析。結(jié)果：在選擇的分析條件下，樣品中的8種組分獲得了理想分離，加標(biāo)回收率在87%～112.8%之間，并采用外標(biāo)法對(duì)8種組分進(jìn)行定量。以這8種組分的含量為指標(biāo)，聚類分析和線性判別分析能對(duì)39種茶葉樣品進(jìn)較好的區(qū)分。

茶多酚；咖啡堿；茶葉；高效液相色譜；聚類分析；線性判別分析

茶葉由茶樹(Camellia sinensis)的葉子加工而成，是我國(guó)傳統(tǒng)的飲料之一，也是世界三大飲料之一，按照發(fā)酵程度的不同，分為綠茶、黃茶、白茶、青茶(烏龍茶)、紅茶、黑茶(普洱茶)等。綠茶為不發(fā)酵的茶，含有大量茶多酚及一定量的生物堿，如咖啡因、可可堿等(圖1)，大約占干質(zhì)量的30%[1]。烏龍茶為半發(fā)酵茶，而紅茶則是全發(fā)酵的茶，兒茶素的含量相比綠茶偏低，而咖啡因含量則有所增加。兒茶素類物質(zhì)賦予茶湯苦、澀味以及特有的收斂性。此外，茶多酚具有抗氧化，抗動(dòng)脈粥樣硬化，降低血液膽固醇，抑制癌細(xì)胞增殖等多種生理活性[2-5]?？Х纫?、可可堿是茶葉中的生物堿類，可賦予茶湯苦味，并具有祛除疲勞，興奮神經(jīng)的作用[6]。因此，茶多酚和咖啡因是茶葉品質(zhì)的重要因子。

圖1 茶多酚和咖啡因、可可堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of catechin, caffeine and theobromine

本實(shí)驗(yàn)擬建立一種反相高效液相色譜方法，快速測(cè)定茶葉中兒茶素[(+)-catechin，C]、表兒茶素[(-)-epicatechin，EC]、表兒茶素沒食子酸脂[(-)-epicatechin gallate，ECG]、表沒食子兒茶素[(-)-epigallocatechin， EGC]、表沒食子兒茶素沒食子酸脂[(-)-epigallocatechin gallate, EGCG]、沒食子酸(gallic acid，GA)、咖啡因(caffeine，CAF)、可可堿(theobromine，THEO)的水平。在此基礎(chǔ)上，調(diào)查目前北京茶葉市場(chǎng)上茶葉中茶多酚，咖啡因和可可堿的含量，并采用聚類分析和線性判別分析對(duì)茶葉進(jìn)行區(qū)分，為茶葉的真?zhèn)舞b定提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉購自北京馬連道茶葉市場(chǎng)，未注明的均為新茶，存儲(chǔ)于－18℃冰箱待測(cè)，共計(jì)39種，其中綠茶21種，烏龍茶8種，紅茶4種(其中立頓速溶紅茶1種)，白茶3種，黑茶2種，花茶1種。

兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子酸 美國(guó)Sigma公司；咖啡因、可可堿 中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈(均為色譜純) 美國(guó)Fisher公司；乙酸(優(yōu)級(jí)純) 北京精細(xì)化工廠；VC、EDTA均為分析純。1.2儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜系統(tǒng)(配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和Empower 2色譜工作站) 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 茶多酚和生物堿的提取

參照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》，取適量茶葉樣品于研缽，將其研碎至直徑小于1mm，精確稱取樣品200mg至于10mL離心管中，用移液管移取5mL經(jīng)70℃水浴預(yù)熱的70%甲醇溶液，注入其中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆驖?rùn)濕，立即移入70℃水浴鍋中，浸提10min。每隔5min攪拌一次取出，浸提后冷卻至室溫，轉(zhuǎn)入離心機(jī)在3500r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶，殘?jiān)儆?mL的70%甲醇溶液提取一次，重復(fù)以上操作，合并提取液定容至10mL。用移液管取上述溶液2mL于10mL容量瓶中，用穩(wěn)定液定容，待測(cè)。

穩(wěn)定液配制：稱取250mg EDTA于燒杯中，加入少量pH值為8的NaOH溶液，用玻璃棒攪拌，溶解，再加入50mL乙腈后再加入250mg VC，待其溶解，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，定容至500mL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取2.9mg C、3.0mg EC、2.5mg ECG、3.7mg EGC、2.9mg EGCG、2.4mg CAF、1.0mg THEO，用70%

甲醇溶液溶解，定容至10mL，然后逐級(jí)稀釋得到一系列不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。0.45μm膜過濾，進(jìn)樣10μL，進(jìn)行HPLC分析。以進(jìn)樣化合物質(zhì)量m(μg)為橫坐標(biāo)、色譜峰面積A為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為迪馬Inertsil ODS-3 C18柱(4.6mm×150mm，5μm)。流動(dòng)相A為100%甲醇，流動(dòng)相B為2%乙酸溶液，采用等度洗脫，流動(dòng)相由甲醇(A)，2%的乙酸(B)，體積比為25:75，流速1mL/min，柱溫30℃。二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)2 7 8 n m，參考波長(zhǎng)210nm。

1.3.4 茶多酚和生物堿的HPLC測(cè)定

茶葉樣品如1.3.1節(jié)處理后，采用1.3.2節(jié)同樣的色譜條件進(jìn)行HPLC分析。根據(jù)各化合物的峰面積，計(jì)算其含量，并根據(jù)稀釋度，計(jì)算茶多酚和生物堿的含量。

稱取200mg茶葉樣品6份，其中3份測(cè)定8種化合物的質(zhì)量，另外3份加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品后，測(cè)定8種化合物的質(zhì)量，然后計(jì)算其加標(biāo)回收率。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

以C、EC、ECG、EGC、EGCG、GA、CAF和THEO這8種成分為指標(biāo)，用SPSS 14.0 進(jìn)行聚類分析和線性判別分析[7]。聚類分析計(jì)算歐氏距離，線性判別分析則采用逐步判別法。

2 結(jié)果與分析

2.1 同時(shí)測(cè)定茶多酚和生物堿的HPLC方法建立

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)過HPLC分析，等度洗脫，得到HPLC圖譜見圖2?？梢钥闯?，這6種茶多酚和2種生物堿得到了較好的分離，僅有EGCG和CAF基線部分有重疊。8種化合物的保留時(shí)間分別為GA 2.629min、THEO 3.294min、EGC 3.998min、C 4.573min、EGCG 6.611min、CAF 7.233min、EC 8.060min、ECG 15.111min。

圖2 茶多酚和生物堿的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of tea polyphenols and alkaloids

從表1可以看出，8種化合物的回歸方程的R2均大于0.9999，說明在線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

表1 茶葉中C、EC、ECG、EGC、EGCG、GA、CAF和THEO的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table1 Regression equations of 8 compounds (C, EC, ECG, EGC, EGCG, GA, CAF and THEO) in tea samples

這8種化合物的加標(biāo)回收率如表2所示，回收率在87.0%～112.8%之間，說明該提取和測(cè)定方法能準(zhǔn)確的反應(yīng)茶葉樣品中這8種化合物的準(zhǔn)確含量。

表2 茶葉中C、EC、ECG、EGC、EGCG、GA、CAF和THEO的回收率(n=3)Table2 Recovery rates of spiked compounds (C, EC, ECG, EGC, EGCG, GA, CAF and THEO) in tea samples (n=3)

2.2 茶葉中茶多酚和生物堿水平

圖3 綠茶、白茶、烏龍茶和紅茶中C、E C、E C G、E G C、EGCG、GA、CAF、THEO、總生物堿和總茶多酚的平均含量Fig.3 Average contents of 8 compounds (C, EC, ECG, EGC, EGCG, GA, CAF and THEO), total alkaloids (TA) and total polyphenols (TPP) in green, white, oolong and black tea samples from Beijing market

39種茶葉樣品經(jīng)過如上方法提取，HPLC測(cè)定，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到其中C、EC、ECG、EGC、EGCG、GA、CAF和THEO的含量，如表3所示。計(jì)算綠茶、白茶、烏龍茶、紅茶的8個(gè)指標(biāo)，外加T A (CAF和THEO之和)，TPP(其他6指標(biāo)之和)的平均水平，并采用SPSS14.0進(jìn)行Duncan多重比較，得到圖3。

表3 茶葉中C、EC、ECG、EGC、EGCG、GA、CAF和THEO的含量Table3 Contents of 8 compounds (C, EC, ECG, EGC, EGCG, GA, CAF and THEO) in tea samples

綠茶為非發(fā)酵茶，白茶、烏龍茶和紅茶的發(fā)酵程度逐漸加重，發(fā)酵方式也不一樣。從圖3可以看出，北京市場(chǎng)茶葉中總生物堿的含量在0.694%～3.454%之間，平均含量2.395%。單因素方差分析顯示，綠茶，白茶，烏龍茶和紅茶的總生物堿含量在α=0.05水平上無顯著差別，Duncan多重比較顯示4類茶葉的總生物堿也無顯著差別。這說明發(fā)酵對(duì)茶葉中生物堿的水平基本無影響。

總茶多酚含量在2.815%～19.808%之間，平均含量11.205%，含量從高到低依次為綠茶，白茶，烏龍茶和紅茶。單因素方差分析顯示茶葉種類對(duì)TPP水平有極顯著影響(P＜0.001)，Duncan多重比較顯示，在α=0.05水平上，綠茶和烏龍茶TPP水平無顯著差異，和白茶，紅茶有顯著差異，這說明發(fā)酵方式對(duì)茶葉中茶多酚的含量有極顯著影響。

茶葉中茶多酚以EGCG、EC、ECG為主，C和EGC含量較低，GA含量則是在綠茶，白茶中較高，烏龍茶，紅茶中含量較低。單因素方差分析顯示茶葉種類對(duì)茶葉中C、EC、ECG、EGC、EGCG和GA的含量

都有顯著影響(P＜0.005)。Duncan多重比較顯示，在α=0.05水平上，烏龍茶的EGCG含量與其他3類茶葉有顯著差異，E C含量只有白茶和烏龍茶之間有顯著差異，綠茶的ECG含量則與白茶和紅茶之間有顯著差異。

2.3 茶葉的聚類分析

采用SPSS 14.0軟件包中聚類分析程序，計(jì)算39種茶葉樣品之間的歐氏距離，進(jìn)行聚類分析聚類結(jié)果見圖4。

圖4 39個(gè)茶葉樣品系統(tǒng)聚類分析圖Fig.4 Hierarchical cluster analysis of 39 tea samples

從圖4可看出，當(dāng)臨界值為20時(shí)，39個(gè)茶葉樣品分別聚為三類。第一類中包含19個(gè)綠茶，1個(gè)花茶1個(gè)烏龍茶和1個(gè)白茶。第二類中包含7個(gè)烏龍茶、2個(gè)綠茶、1個(gè)黑茶。第三類中包含3個(gè)紅茶、2個(gè)白茶、1個(gè)黑茶和1個(gè)立頓紅茶。這三類茶葉按發(fā)酵度逐漸遞增分類，分別是不發(fā)酵，半發(fā)酵和全發(fā)酵茶。第一類茶均為不發(fā)酵或低發(fā)酵度的茶。第二類茶主要是烏龍茶等半發(fā)酵茶，還含有少量綠茶。第三類茶主要為紅茶和黑茶，為全發(fā)酵的茶。有趣的是，33w和34w兩種白茶是輕度發(fā)酵的茶也聚到第三類中，其原因可能是33w和34w分別是07年春和08年春的茶。由于茶葉放置的時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致茶葉中的兒茶素類成份發(fā)生降解，所以被聚入第三類。因此，按照C、EC、ECG、EGC、EGCG、GA、CAF、THEO組分含量進(jìn)行分類是合理的。

2.4 茶葉的判別分析

用SPSS 14.0軟件包，采用Wilk sλ法對(duì)茶葉樣品進(jìn)行逐步線性判別分析，得到2個(gè)典則判別函數(shù)(Y)，分別為Y1=1.169+0.535EGCG+1.285ECG－5.523CAF、Y2=－2.897－0.349EGCG+1.82ECG+1.058CAF。計(jì)算各茶葉樣品的得分，以Y1為橫坐標(biāo)、Y2為縱坐標(biāo)，得到茶葉樣品線性判別圖(圖5)。82.9%的茶葉樣品分類正確，綠茶，紅茶和烏龍茶完全區(qū)分，白茶區(qū)分不太好，可能原因是其為往年陳茶，其中的茶多酚有一定程度的氧化聚合。

圖5 綠茶、白茶、烏龍茶和紅茶的線性判別分析Fig.5 Linear discrimination analysis of green, white, oolong and black tea samples

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)建立的提取及HPLC方法，可同時(shí)測(cè)定茶葉中咖啡因，可可堿以及6類茶多酚含量。雖然采用了等度洗脫，但8種化合物基本實(shí)現(xiàn)了基線分離(EGCG和CAF峰有少部分重合)，基線平，能在18min內(nèi)完成測(cè)定，且8種化合物回收率均達(dá)到要求。Ferandez等[8]采用梯度洗脫方式，6種兒茶素流出需要20min，而且基線漂移嚴(yán)重；康海寧等[9]采用梯度洗脫，則需要左右；唐根源等[10]采用等度洗脫，需要30min左右；Mitsuaki等[11]采用等度洗脫，分析12種茶多酚需要時(shí)間大概110min。

采用此方法對(duì)39個(gè)茶葉樣本中的上述8中化合物進(jìn)行了測(cè)定?？偵飰A含量平均為2.395%，茶多酚總量平均為11.205%，以EGCG、EC、ECG為主。綠茶、白茶、烏龍茶和紅茶中咖啡因、可可堿的含量并無顯著差別，說明發(fā)酵處理，并不能將其有效去除。4種茶葉茶多酚含量有顯著性區(qū)別，說明發(fā)酵對(duì)兒茶素類物質(zhì)具有很大影響。發(fā)酵過程中，兒茶素類物質(zhì)氧化聚合，形成茶黃素和茶紅素，形成烏龍茶、紅茶的獨(dú)特風(fēng)味與茶湯顏色。隨著發(fā)酵程度的增加，綠茶、烏龍茶和紅茶中茶多酚的含量逐漸減少。這與Ferandez等[8]和朱勤艷等[12]研究結(jié)果一致。但是白茶作為一種發(fā)酵程度低于烏龍茶的茶葉，其總多酚低于烏龍茶，其原因可能是本實(shí)驗(yàn)選擇的白茶樣本為往年陳茶，其中的茶多酚已發(fā)生氧化聚合所致，有研究證明，綠茶在90%相對(duì)濕度，40℃條件下貯藏45d兒茶素下降了31%[13]，說明茶多酚在貯藏條件下會(huì)氧化聚合，從而含量下降。

聚類分析將茶葉分為了3大類，基本符合實(shí)際情況。通過逐級(jí)線性判別分析，利用EGCG、ECG和CAF構(gòu)成的判別方程，將茶葉分為了4大類，綠茶、烏龍茶和紅茶完全區(qū)分，白茶區(qū)分效果不好。雖然白茶樣

品選擇不當(dāng)，干擾了分類方法的表現(xiàn)，但是利用這2種方法，用于茶葉種類的區(qū)分、鑒別是可能的。

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Determination of Polyphenols and Alkaloids in Tea and Cluster-Linear Discrimination Analysis

XIAO Jun-song1,2，YUAN Ying-hao1，ZHANG Ai-xue1，CAO Yan-ping1,2,*
(1. School of Chemical and Environmental Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing 100048, China)

Objective: To establish a HPLC method for the determination of (+)-catechin, (-)-epicatechin (EC), (-)-epicatechin gallate (ECG), (-)-epigallocatechin (EGC), (-)-epigallocatechin gallate (EGCG), gallic acid (GA), caffeine (CAF) and theobromine (THEO) in green, oolong and black tea samples, and to develop a discrimination method for green, oolong and black tea by cluster analysis and linear discrimination analysis on the basis of determined chemical components. Methods: Tea samples were extracted by 70% aqueous methanol. Totally 200 mg of grinded tea samples was extracted with 5 mL of 70% aqueous methanol for 10 min in 70 ℃water bath. The extract was centrifuged at 3500 r/min for 10 min, and the supernatant was collected. Then the precipitate was extracted with 5 mL of 70% methanol under the same conditions. The supernatants were combined in a volumetric flask and diluted to 10 mL. A total of 2 mL of such solution was diluted by 5 times with stabilizing solution, filtrated with 0.45 μm membrane, and then used for HPLC analysis. Eight compounds were separated by a C18 column using a mobile phase containing methanol-2% aqueous acetic acid at a ratio of 25:75 (V/V) in an isocratic elution at 30 ℃, and detected using a photodiode array detector at 278 nm with the reference wavelength at 210 nm. The cluster and linear discrimination analyses were performed using SPSS 14.0 software. Results: Eight compounds in all tea samples were well separated under the proposed conditions. The recovery rates of spiked samples were in the range of 87%－112.8%. The contents of 8 compounds determined by an external standard method were used to conduct cluster analysis and linear discrimination analysis. The good differentiation of green, oolong and black tea samples were achieved. Conclusion: This established method is feasible to discriminate green, oolong and black tea.

tea polyphenol；caffeine；tea；high performance liquid chromatography (HPLC)；cluster analysis；linear discrimination analysis

TS255.36

A

1002-6630(2010)22-0343-06

2010-07-08

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD27B03)；北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(3062007)

肖俊松(1980—)，男，講師，博士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail：waq0012@hotmail.com

*通信作者：曹雁平(1961—)，男，教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)與物理場(chǎng)強(qiáng)化技術(shù)研究。E-mail：caoyp@th.btbu.edu.cn