QuEChERS結(jié)合GC—MS/MS—內(nèi)標法測定川麥冬中多效唑殘留量

茍琰 高馳 鄧晶晶 李紅彥 耿昭 周娟 袁軍 李敏

中圖分類號 R932；R927.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）03-0323-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.03.09

摘 要 目的：建立測定川麥冬中多效唑殘留量的方法，并用于檢驗不同來源的川麥冬藥材質(zhì)量。方法：收集50批不同產(chǎn)地、市場和企業(yè)來源的川麥冬樣品，樣品前處理方法為QuEChERS法，即樣品加水經(jīng)乙腈提取，以QuEChERS提取包（含無水硫酸鎂與無水乙酸鈉等）進行鹽析，提取液再經(jīng)QuEChERS凈化包（含無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺、十八烷基硅烷鍵合硅膠、硅膠、石墨化炭黑）凈化后加入內(nèi)標磷酸三苯酯，采用氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS/MS）法測定川麥冬樣品中多效唑殘留量。色譜柱為DB-5MS，程序升溫，檢測器為三重四級桿質(zhì)譜，載氣初始流速為1.3 mL/min，采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測，不分流進樣。結(jié)果：多效唑檢測質(zhì)量濃度線性范圍為1.01～505 ng/mL（r=0.999 7），精密度試驗、穩(wěn)定性試驗（24 h）、重復(fù)性試驗的RSD分別為3.94%、13.62%、7.54%（n=6），方法回收率平均值為111.26%（RSD=5.43%，n=9）；在50批樣品中的多效唑檢測結(jié)果為0.02～2.72 mg/kg。結(jié)論：建立的多效唑檢測方法操作簡便、結(jié)果準確、靈敏度及重復(fù)性好，可用于川麥冬中多效唑殘留量的檢測；不同來源的川麥冬樣品中多效唑殘留量相差較大。

關(guān)鍵詞 川麥冬；氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法；內(nèi)標；多效唑；殘留量

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for measuring the paclobutrazol residue in Ophiopogon japonicus from Sichuan and detect the quality of O. japonicus from Sichuan from different sources. METHODS： Totally 50 batches of samples were collected from different origin places， commercial markets and manufacturers. The sample pretreatment method was QuEChERS method， .ie the sample was extracted by aqueous acetonitrile， salted out by QuEChERS extract package （containing anhydrous magnesium sulfate and anhydrous sodium acetate）， the extract solution was purified by QuEChERS purification package （containing anhydrous magnesium sulfate， N-propyl ethylenediamine， octadecylsilane chemically bonded silica， silica gel， graphitized carbon black） and then added into internal standard triphenyl phosphate. The paclobutrazol residue in O. japonicus from Sichuan was determined by GC-MS/MS. The determination was performed on DB-5MS column. The temperature programming was adopted， and the detector was triple quadrupole MS detector. The initial flow rate of carrier gas was 1.3 mL/min； acquisition mode was MRM. Injection method was splitless injection. RESULTS： The linear range of paclobutrazol was 1.01-505 ng/mL （r= 0.999 7）. RSDs of precision， stability （24 h） and repeatability tests were 3.94%， 13.62%， 7.54% （n=6）， respectively. Average method recovery was 111.26% （RSD=5.43%， n=9）. The paclobutrazol residue in 50 batches of sample were 0.02-2.72 mg/kg. CONCLUSIONS： Established method is simple， accurate， sensitive and reproducible. It also can be used for the determination of paclobutrazol residue in O. japonicus from Sichuan. The contents of paclobutrazol residue in O. japonicus from Sichuan from different sources are different greatly.

KEYWORDS Ophiopogon japonicus from Sichuan； GC-MS/MS； Internal standard； Paclobutrazol； Residue

麥冬，又名沿階草、書帶草、麥門冬，收載于2015年版《中國藥典》（一部）中，為百合科植物麥冬[Ophiopogon japonicus（L.f） Ker-Gawl]的干燥塊根，為常用中藥，具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心的功效[1]。麥冬的主產(chǎn)地為四川和浙江，前者稱為“川麥冬”，栽種年限常為1年，而后者稱“浙麥冬”，栽種年限常為3年；據(jù)報道，麥冬的主要成分為麥冬皂苷Ra和麥冬皂苷D′ 等[2]。筆者根據(jù)前期市場調(diào)研情況，發(fā)現(xiàn)目前川麥冬在市場上占有率達70%以上，而其在栽培過程中大量使用了以多效唑為主的植物生長調(diào)節(jié)劑[3]，這種生長調(diào)節(jié)劑能夠顯著促進麥冬塊根的形成，增加產(chǎn)量。同時，多效唑是一種三唑類植物生長調(diào)節(jié)劑，能改變作物的內(nèi)源激素水平，提高植株的抗逆性[4]。本課題組在前期進行產(chǎn)地走訪時發(fā)現(xiàn)，農(nóng)戶在川麥冬種植中對多效唑的使用量參差不齊，少數(shù)極端情況下甚至超過了每畝20 kg（1畝=666.667 m2）。目前，對于川麥冬中多效唑的使用量和殘留量并未做出明確的相關(guān)的法規(guī)，這不利于規(guī)范化種植管理，并會存在一定的安全隱患和影響藥材質(zhì)量。因此，建立一種能簡便、準確地測定麥冬中多效唑殘留量的方法很有必要。

QuEChERS法是一種最先應(yīng)用于果蔬中的農(nóng)藥殘留量檢測前處理方法，即Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe英文字母的縮寫，該法廣泛應(yīng)用于農(nóng)殘檢測的樣品前處理中[5-6]。在2015年版《中國藥典》（四部）通則2341中的第四法[7]，其樣品前處理即采用此方法。本研究采用QuEChERS法對樣品進行前處理，再以氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（GC-MS/MS）-內(nèi)標法為分析方法，建立了麥冬樣品中多效唑殘留量的檢測方法，并根據(jù)多渠道收集的樣品的檢測結(jié)果進行分析，為川麥冬種植栽培的規(guī)范化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

TQ8040三重四級桿GC-MS/MS儀，配有電子轟擊源（EI） （日本Shimadzu 公司）；AOC-6000 CTC進樣器（瑞士 CTC Analytics公司）；MS3 digital渦旋振蕩器（德國Ika公司）；3-30k離心機（德國Sigma公司）；Millipore Q純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；CPA225十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

川麥冬樣品50批均為四川產(chǎn)，生長年限均為1年；多效唑?qū)φ掌啡芤海ū本┞裆锟萍加邢薰?，批號?4667XB，質(zhì)量濃度：101 μg/mL）；磷酸三苯酯（TPP，內(nèi)標，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，批號：50327，純度：99.90%）；核糖酸內(nèi)酯（批號：LA30R07，純度：97%）、山梨醇（批號：LR90Q138，純度：98%）均來源于北京百靈威科技有限公司；WondaPak QuEChERS醋酸鈉提取包及固相萃取凈化管（日本Shimadzu公司）；乙腈和丙酮均為色譜純（美國Fisher Chemical公司）；冰乙酸為分析純。50批樣品來源及采集時間見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱為DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱溫采用程序升溫；檢測器為三重四級桿MS；初始溫度為40 ℃，然后以20 ℃/min升至220 ℃，再以35 ℃/min升至300 ℃，保持5 min。載氣為氦氣，流速采用線速度控制模式，初始流速為1.3 mL/min；電子轟擊（EI）離子源為70 eV，離子源溫度為200 ℃，接口溫度為280 ℃。數(shù)據(jù)采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），不分流進樣；多效唑與內(nèi)標的具體監(jiān)測離子對及碰撞能量值等詳見表2。

2.2 溶液的制備

2.2.1 內(nèi)標-分析保護劑溶液 取核糖酸內(nèi)酯0.5 g，加乙腈25 mL使溶解，得A液，每mL溶液含20 mg核糖酸內(nèi)酯；另取山梨醇0.25 g，加水12.5 mL溶解，加乙腈至25 mL，得B液，每mL溶液含10 mg山梨醇。取上述A、B溶液合并，搖勻，精密加入內(nèi)標貯備溶液（精密稱取內(nèi)標適量，加乙腈制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的溶液）2.5 mL，搖勻，即得（每mL溶液含內(nèi)標約50 ng）。

2.2.2 對照品貯備溶液 精密量取多效唑?qū)φ掌啡芤海?01 μg/mL）1 mL，置于50 mL量瓶中，加丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為多效唑?qū)φ掌焚A備溶液（質(zhì)量濃度為2.02 μg/mL）。

2.2.3 供試品溶液 按QuEChERS法進行前處理。取麥冬樣品，40 ℃烘干后粉碎，取粉末，過三號篩；取約3.0 g，精密稱定，置于50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入1 %冰醋酸溶液15 mL，渦旋，使藥粉充分浸潤，放置30 min；精密加入乙腈15 mL，置于振蕩器上劇烈振蕩（3 000次/min）5 min，于冰浴中冷卻30 min；加入QuEChERS提取包[含無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末（4 ∶ 1，m/m）7.5 g]，立即搖散，再置于振蕩器上劇烈振蕩（3 000次/min）3 min，于冰浴中冷卻10 min，離心 （5 000 r/min）5 min。取上清液8 mL，置于已預(yù)先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管中，凈化管中加入QuEChERS的凈化包[含無水硫酸鎂900 mg，N-丙基乙二胺（PSA）300 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg，硅膠300 mg，石墨化炭黑90 mg]，渦旋使充分混勻；再置于振蕩器上劇烈振蕩（3 000次/min） 5 min使凈化完全，離心（5 000 r/min） 5 min；精密量取上清液3 mL，氮氣吹至近干，加丙酮使溶解并定容至2 mL，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

分別精密量取對照品貯備溶液和供試品溶液各1 mL，精密加入內(nèi)標-分析保護劑溶液0.3 mL，搖勻，進樣測定，記錄色譜圖。多效唑及內(nèi)標的提取離子流圖見圖1；對照品貯備溶液和供試品溶液（樣品編號為1）的總離子流圖見圖2。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.2”項下的對照品貯備溶液，按照比例用丙酮稀釋制得質(zhì)量濃度分別為505、202、101、50.5、20.2、10.1、5.05、2.02、1.01 ng/mL的溶液；分別精密吸取各溶液1 mL，精密加入內(nèi)標-分析保護劑溶液0.3 mL，搖勻；精密吸取1 μL，注入GC-MS/MS儀中進行測定，記錄峰面積，以多效唑峰面積/內(nèi)標峰面積為橫坐標（x）、多效唑?qū)φ掌焚|(zhì)量濃度為縱坐標（y），繪制標準曲線，計算得回歸方程為：y=9.846 2x-0.330 3（r=0.999 7），結(jié)果表明多效唑檢測質(zhì)量濃度線性范圍為1.01～505 ng/mL。

2.5 精密度考察

精密吸取“2.4”項下混合對照品溶液中質(zhì)量濃度為10.1 ng/mL的溶液1 mL，精密加入內(nèi)標-分析保護劑溶液0.3 mL，搖勻；精密吸取1 μL，注入GC-MS/MS儀中，重復(fù)進樣6次，測定，記錄峰面積。計算得峰面積的RSD為3.94%（n=6），表明儀器精密度能滿足試驗要求。

2.6 定量限與檢測限考察

精密量取質(zhì)量濃度為1.01 ng/mL的多效唑?qū)φ掌啡芤?，倍比稀釋，以信噪?0 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算方法定量限和方法檢測限。結(jié)果，多效唑定量限為0.6 μg/kg、檢測限為0.2 μg/kg。

2.7 穩(wěn)定性考察

取“2.2.3”項下的供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、16、24 h時，按“2.1”項條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，峰面積的RSD為13.62%（n=7）。表明供試品溶液在室溫下放置24 h時基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性考察

取樣品（樣品編號為1），共6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項條件進樣測定。結(jié)果，6份樣品含量的RSD為7.54%（n=6），表明本方法重復(fù)性符合要求。

2.9 加樣回收率試驗

采用本課題組前期研究中試驗田的空白樣品進行加樣回收試驗，在空白樣品中精密加入多效唑?qū)φ掌焚A備溶液（2.02 μg/mL）適量，制成3個質(zhì)量濃度（10.1、20.2、50.5 ng/mL）的溶液，每個濃度制備3份樣品，共9份，按上述方法和色譜條件進行樣品處理和測定，結(jié)果平均回收率為111.26%（RSD=5.43%，n=9），詳見表3。

2.10 樣品中多效唑殘留量測定結(jié)果

以建立的方法對所采集的50批川麥冬樣品中多效唑殘留量進行檢測（n=2），結(jié)果在各樣品中均檢出了多效唑，詳見表4。

3 討論

3.1 關(guān)于多效唑殘留量

根據(jù)文獻報道，藥材種植過程中若長期使用多效唑等植物生長調(diào)節(jié)劑，可能導(dǎo)致藥材畸形、空心、不耐貯藏、環(huán)境污染等負效應(yīng)[8-9]；長期食用含植物生長調(diào)節(jié)劑的水果或藥材，會影響人們身體健康[10]。多效唑?qū)儆谝环N低毒的植物生長調(diào)節(jié)劑，其性質(zhì)較為穩(wěn)定，容易在藥材中殘留，因此各國都有嚴格的規(guī)定，如日本對生姜、長蔥、洋蔥、胡蘿卜、蘿卜、蒿菜、黃瓜等蔬菜上的多效唑殘留為“一律標準”（即 0.01 mg/kg），美國、歐盟國家、韓國等對上述蔬菜中的多效唑殘留則要求為“不得檢出”[11]。

本課題組前期在四川省三臺縣進行產(chǎn)地調(diào)研時發(fā)現(xiàn)，當?shù)剞r(nóng)戶使用多效唑相當普遍。對此，當?shù)卣疄榇龠M產(chǎn)業(yè)有序發(fā)展也出臺了相關(guān)的措施，包括推行使用多效唑懸乳劑和水劑，同時還推薦了使用劑量。本研究共收集到50批樣品，其中市場樣品7批、種植公司及合作社12批、飲片企業(yè)6批、田間采集25批，樣品來源渠道覆蓋面廣，具有一定代表性。根據(jù)對50批川麥冬中多效唑殘留量的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)多效唑殘留量范圍為0.02～2.72 mg/kg，批次差異巨大，故筆者認為當?shù)卣扑]的使用劑量在實際種植中可能并未被嚴格遵照執(zhí)行。

目前對中藥材及飲片中多效唑的殘留限量，國家尚無明確的要求和規(guī)定，麥冬在中醫(yī)傳統(tǒng)養(yǎng)生學(xué)中常被視作食藥兩用的代表品種。對比國家食品標準GB-2763- 2016[12]，多效唑的限度范圍一般在0.05～0.5 mg/kg（在稻谷和小麥中為0.5 mg/kg，在油菜籽中為0.2 mg/kg，在大豆中為0.05 mg/kg，在蘋果和荔枝中為0.5 mg/kg，在芒果中為0.05 mg/kg），在本研究的麥冬中，多效唑殘留量相對食品中較高，需特殊對待以及進行進一步研究，以保證當?shù)佧湺a(chǎn)業(yè)在健康發(fā)展的同時，又不影響其市場供需環(huán)境。

3.2 關(guān)于多效唑殘留量的檢測方法

多效唑的殘留檢測目前主要在果蔬中報道較多[11，13-18]，對中藥材中多效唑殘留量的檢測近年來也獲得了一定關(guān)注[19-20]，主要有以液相色譜和液相色譜-MS聯(lián)用分析與固相萃取柱柱前處理凈化樣品相結(jié)合的方法，也有采用氣相色譜-電子捕獲檢測器串聯(lián)（GC-μECD）法進行分析，樣品前處理多為液液萃取[21]。本課題組通過前期研究[22]，建立了麥冬中農(nóng)藥殘留的快速篩查方法，通過篩查發(fā)現(xiàn)在川麥冬中多效唑?qū)儆诟邫z出、高殘留物，故本研究針對多效唑建立了檢測方法。與農(nóng)藥殘留篩查不同，本研究針對多效唑檢測，重新優(yōu)化了色譜條件和質(zhì)譜條件，縮短了檢測（主要是儀器分析時間）時間并提高了目標物靈敏度。樣品處理采用操作較為簡單的QuEChERS法，并在測定前加入內(nèi)標-分析保護劑溶液，這樣在計算結(jié)果時，由于GC對于目標物和內(nèi)標均存在基質(zhì)增強效應(yīng)，代入內(nèi)標進行計算可消除由于基質(zhì)效應(yīng)帶來的誤差，使定量結(jié)果更準確。本研究方法與已報道常見色譜法比較具有以下優(yōu)點：第一，MS檢測比普通的檢測器檢測的選擇性更強，一般不會帶來假陽性結(jié)果；第二，固相萃取柱前處理和液液萃取處理樣品的方法，在實際操作中均包括比較煩瑣的操作步驟；第三，本研究之所以選擇GC-MS/MS而不是液相色譜-MS/MS進行檢測，是因為前者的整個系統(tǒng)更容易穩(wěn)定，包括保留時間、精密度等更容易得到保證，適于推廣。

3.3 關(guān)于QuEChERS法

QuEChERS是近年來在國際上發(fā)展起來的一種農(nóng)藥殘留檢測的快速樣品前處理技術(shù)[5-6]，最先應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中，其簡單有效、安全快速的特點非常適合于基質(zhì)復(fù)雜的樣品前處理。對于麥冬，因其含有多糖類、黃酮類、皂苷類等多種成分，基底較為復(fù)雜。故本研究將QuEChERS法應(yīng)用于麥冬的樣品前處理，該法在實際操作中，僅需要在稱樣后，加入水，一般放置0.5 h后，加入提取包，振搖，放置，再加入凈化包，振搖，離心，濃縮，即可完成整個試驗操作，操作具有簡便性；相對于已經(jīng)報道的蔬菜水果中的QuEChERS法，本法針對中藥材增加了加水的步驟，并針對GC-MS/MS進樣，將溶劑替換為丙酮，更適合進行GC-MS/MS檢測。

綜上，本研究建立的多效唑殘留量檢測方法操作簡便、結(jié)果準確、靈敏度及重復(fù)性好，可用于川麥冬中多效唑殘留量的檢測；不同來源的川麥冬樣品中多效唑殘留量相差較大。本研究的結(jié)果可為政府制訂麥冬種植栽培的規(guī)范化生產(chǎn)的質(zhì)量控制標準提供參考依據(jù)。

參考文獻

[ 1 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：155-156.

[ 2 ] 胥秀英，鄭一敏，傅善權(quán)，等. HPLC法同時測定麥冬藥材中麥冬皂苷Ra和慈溪麥冬皂苷A的含量[J].中國藥房，2010，21（39）：3704-3705.

[ 3 ] 包小紅，茍琰，魏伯平，等.麥冬中外源性有害物質(zhì)的分析[J].中成藥，2017，39（9）：1969-1971.

[ 4 ] 賈洪濤.植物生長延緩劑：多效唑[J].農(nóng)技服務(wù)，2004（1）：60-61.

[ 5 ] SCHENCK FJ，HOBBS JE. Evaluation of the quick，easy，cheap，effective，rugged，and safe （QuEChERS） approach to pesticide residue analysis[J]. Bull Environ Contam Toxicol，2004，73（1）：24-30.

[ 6 ] 董靜，潘玉香，朱莉萍，等.果蔬中54種農(nóng)藥殘留的QuEChERS/GC-MS快速分析[J].分析測試學(xué)報，2008，27（1）：66-69.

[ 7 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S]. 2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：212-224.

[ 8 ] 林秋霞，李敏，羅遠鴻，等.植物生長調(diào)節(jié)劑對川麥冬生長發(fā)育影響的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2014，25（8）：1994- 1996.

[ 9 ] 林秋霞，李敏，周海玉，等.植物生長調(diào)節(jié)劑對川麥冬總皂苷和總多糖含量的影響研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2014，16（5）：399-401，409.

[10] 何瑞，劉艾平，曹玉廣.植物生長調(diào)節(jié)劑使用中的安全問題[J].中國衛(wèi)生監(jiān)督雜志，2003，10（2）：99-101.

[11] 包媛媛，張新永，邵金良.多效唑在番茄和土壤中的殘留與降解動態(tài)研究[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報，2014，23（5）：864- 869.

[12] 國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，農(nóng)業(yè)部，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品中農(nóng)藥最大殘留限量 GB-2763-2016[S]. 2016-12-18.

[13] 徐國鋒，聶繼云，李靜，等. GC/ECD測定葡萄中多效唑和烯效唑的殘留[J].農(nóng)藥，2014，53（10）：736-738，755.

[14] 呂燕，趙健，楊挺，等.氣相色譜質(zhì)譜法檢測蔬菜中多效唑的殘留[J].中國測試，2010，36（4）：57-59.

[15] 黃琦，黃戰(zhàn)威，陳振威，等.氣相色譜-質(zhì)譜法快速檢測芒果園土壤中多效唑[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，46（6）：1042- 1046.

[16] 孫星，丁悅，汪佳蕾，等. QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定果蔬中多效唑殘留[J].食品科學(xué)，2014，35（8）：76-79.

[17] 張敏，閆超杰，付海濱，等.固相萃取凈化-高效液相色譜測定水果中赤霉素、多效唑、烯效唑殘留量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40（2）：192-195.

[18] 宋瑩，張耀海，黃霞，等.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測水果中的多效唑殘留[J].分析化學(xué)，2011，39（8）：1270- 1273.

[19] 翟宇瑤，郭寶林.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定4種植物生長延緩劑在6種根及根莖類藥材中殘留量[J].中國中藥雜志，2017，42（11）：2110-2116.

[20] 楊言琛，張興國，郝安輝，等. HPLC法測定麥冬及環(huán)境中多效唑的殘留量[J].西部中醫(yī)藥，2016，29（9）：37-39.

[21] 林秋霞.植物生長調(diào)節(jié)劑對川麥冬質(zhì)量的影響研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

[22] 茍琰，耿昭，吳強，等.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測麥冬中農(nóng)藥殘留[J].中國藥學(xué)雜志，2018，53（7）：555-560.

（收稿日期：2018-10-11 修回日期：2018-11-27）

（編輯：劉 萍）