半夏厚樸湯標準湯劑質(zhì)量標準研究

李 坤,李明花?,秦文杰,楊曉寧,魏寶霞,倪 艷

(1.山西省中醫(yī)藥研究院,山西 太原030000；2.北京振東光明藥物研究院有限公司,北京100085)

隨著生活節(jié)奏的加快,人們面對生活、工作壓力的情志波動起伏較大,進而造成氣機不暢,致使梅核氣等雜病的發(fā)生率明顯增高[1]。梅核氣是中醫(yī)內(nèi)科郁癥范疇中的一種疾病,中醫(yī)常用的治療手段有藥物治療、針灸治療及心理治療[2-3]。其中,藥物治療多為理氣劑,主要以行氣、理氣、降逆為主,代表方劑為半夏厚樸湯。

半夏厚樸湯源自漢代張仲景的《金匱要略》[4],原文記載：“婦人咽中如有炙臠,半夏厚樸湯主之”,本方由半夏、厚樸、茯苓、生姜、紫蘇葉組成,五藥合用,辛以開結(jié),苦能降逆,具有行氣散結(jié)、降逆化痰的功效[5],是主治咽喉部有異物感的專方[6]。現(xiàn)代研究表明,本方具有鎮(zhèn)嘔止吐、增進腸道功能、鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁等作用[7-8],臨床上常用于梅核氣、慢性咽炎、支氣管哮喘、慢性胃炎等疾病的治療且具有顯著療效[9-11]。但本方在臨床上常以湯劑入藥,存在服用量大、攜帶不便、患者依存性差的問題以及缺乏相應(yīng)的質(zhì)量控制標準等缺陷。因此,本研究基于配方顆粒標準湯劑的概念以半夏厚樸湯湯劑為前藥,研究半夏厚樸湯標準湯劑的成型工藝,同時采用薄層鑒別及HPLC對半夏厚樸湯標準湯劑進行質(zhì)量控制,建立本方標準湯劑的質(zhì)量標準,為半夏厚樸湯顆粒的研究和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695分析型高效液相色譜儀(二極管矩陣檢測器,自動進樣器；Empower Pro色譜工作站)；XSE205型分析天平(METTLER TOLEDO)；ME204電子天平(METTLER TOLEDO)；HH-6D1型電熱恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；薄層自動點樣儀(Linomat-Ⅳ,瑞士CAMAG公司)；薄層色譜成像儀(瑞士CAMAG公司)；Mili-Q5超純水機；硅膠G薄層板(10 cm×10 cm,20171212,青島海洋化工廠)；硅膠GF254薄層板(10 cm×10cm,20171126,青島海洋化工廠)。

1.2 試藥

甲醇(色譜純,20200430,默克股份有限公司))；乙腈(色譜純,JA059930,默克股份有限公司)；甲醇(分析純,20170227,北京化工廠)；磷酸(分析純,20171228,北京化工廠)；乙醇(分析純,20180222,天津市福晨化學試劑廠)；乙酸乙酯(分析純,20160802,天津市光復(fù)科技有限公司)；環(huán)己烷(分析純,20140501,天津市永天化學試劑有限公司)；甲酸(分析純,20141017,天津市福晨化學試劑廠)；乙醚(分析純,20180201,北京化工廠)；三氯甲烷(分析純,20170710,北京化工廠)；丙酮(分析純,20121119,北京化工廠)；甲苯(分析純,20170216,北京化工廠)；石油醚(分析純,20170602,北京化工廠)；乙酸乙酯(分析純,20130808,北京化工廠)；異丙醇(分析純,20171222,北京化工廠)；香草醛(分析純,20171220,北京化工廠)；硫酸(分析純,20171227,北京化工廠)；乙醇(分析純,20171118,北京化工廠)；超純水(Milli-Q制)。

厚樸酚對照品(批號：110729-201513,98.8%)；和厚樸酚對照品(批號；110730-201614,99.3%)；迷迭香酸對照品(批號：111871-201706,90.50%)均購自中國食品藥品檢定研究院；6-姜辣素對照品(批號：j-019-170720,98.0%)購自成都瑞芬思生物科技有限公司；厚樸飲片均購買自山西振東道地藥材有限公司,批號分別為；YP2018061101、YP2018061102、YP2018061103、YP2018061104、YP2018-061105、YP2018061106、YP2018061107、YP2018061108、YP2018061109、YP201806110110；半夏厚樸湯標準湯劑由北京振東光明藥物研究院自制,批號分別為：BTD201808-15、BTD20180817、BTD20180821、BTD20180822、BTD201-80824、BTD20180825、BTD20180828、BTD20180904、BTD20180906、BTD20180910,分別編號為S1－S10。

2 方法與結(jié)果

2.1 半夏厚樸湯標準湯劑的制備

按原方劑量取半夏厚樸湯方中的五味飲片,加水回流提取2次。第一次加入10倍量水,浸泡30 min,回流提取30 min,濾過(100目),濾液另器收集。藥渣再加入8倍量水,回流提取30 min,濾過(100目),濾液合并,低溫減壓濃縮至相對密度為1.07(50℃)的清膏,冷凍干燥,即得半夏厚樸湯凍干粉。

2.2 薄層鑒別

2.2.1 厚樸薄層鑒別[12]取半夏厚樸湯凍干粉0.5 g,精密稱定,加甲醇25mL,超聲處理30 min,過濾,濾液蒸干,殘渣加水25mL使溶解,以乙醚振搖提取2次,每次25 mL,合并乙醚溶液,蒸干,殘渣加甲醇1 mL使溶解,作為供試品溶液。再取厚樸酚對照品、和厚樸酚對照品適量,加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液,作為對照品溶液。照半夏厚樸湯制備方法,同法制備缺厚樸飲片的陰性對照樣品,再按供試品溶液的制備方法,同法制備陰性對照樣品溶液。照薄層色譜(通則0502)試驗,吸取對照品溶液2μL,供試品溶液和陰性樣品溶液各8μL,分別點于同一硅膠GF254薄層板上,以環(huán)己烷－乙酸乙酯－甲酸(15∶5∶0.2)為展開劑,展開,取出,晾干,于紫外光(254 nm)下檢視,結(jié)果見圖1。供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)位置上,顯相同顏色的斑點,且陰性無干擾。

圖1 厚樸藥材薄層鑒別

2.2.2 紫蘇葉薄層鑒別[12]取半夏厚樸湯凍干粉2.0g,精密稱定,加70%乙醇25mL,超聲處理30min,過濾,濾液蒸干,殘渣加水25 mL使溶解,以三氯甲烷振搖提取2次,每次25 mL,棄去三氯甲烷溶液,水層蒸干,殘渣加甲醇1 mL使溶解,作為供試品溶液。再取迷迭香酸對照品適量,加甲醇制成每1mL含1.0 mg的溶液,作為對照品溶液。照半夏厚樸湯制備方法,同法制備缺紫蘇葉飲片的陰性樣品,再按供試品溶液的制備方法,同法制備陰性樣品溶液。照薄層色譜(通則0502)試驗,吸取對照品溶液2μL,供試品溶液和陰性樣品溶液各3μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以環(huán)己烷－乙酸乙酯－異丙醇－甲酸(10∶5∶3.5∶0.5)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,于105℃加熱至斑點顯色清晰,于紫外光(366 nm)下檢視,結(jié)果見圖2。供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)位置上,顯相同顏色的斑點,且陰性無干擾。

圖2 紫蘇葉藥材薄層鑒別

2.2.3 生姜薄層鑒別[12]取半夏厚樸湯凍干粉2.0 g,精密稱定,加甲醇25 mL,超聲處理30 min,過濾,濾液蒸干,殘渣加水25 mL使溶解,以乙酸乙酯振搖提取2次,每次25mL,合并乙酸乙酯溶液,蒸干,殘渣加甲醇1 mL使溶解,作為供試品溶液。另取6-姜辣素對照品適量,加甲醇制成每1mL含1mg的溶液,作為對照品溶液。照半夏厚樸湯制備方法,同法制備缺生姜飲片的陰性樣品,再按供試品溶液的制備方法,同法制備陰性樣品溶液。照薄層色譜(通則0502)試驗,吸取對照品溶液2μL,供試品溶液和陰性樣品溶液各5μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(60～90℃)－三氯甲烷－乙酸乙酯－甲酸(10∶5∶5∶0.3)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5%香草醛硫酸溶液,于105℃下加熱至斑點顯色清晰,檢視,結(jié)果見圖3。供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)位置上,顯相同顏色的斑點,且陰性無干擾。

圖3 生姜藥材薄層鑒別

2.3 含量測定

2.3.1 厚樸飲片含量測定 按照2015年版《中國藥典》一部厚樸含量測定項下的方法測定10批厚樸飲片中厚樸酚與和厚樸酚的含量,得厚樸酚與和厚樸酚的總量為2.76%～3.02%,見表2。結(jié)果表明10批厚樸飲片均滿足藥典(含厚樸酚與和厚樸酚的總量不得少于2.0%)的限量要求。

2.3.2 標準湯劑含量測定 色譜條件：以Phenomenex C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm)為色譜柱；以甲醇－水(78∶22)為流動相；檢測波長：294 nm；柱溫：25℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10μL；理論板數(shù)按厚樸酚計算應(yīng)不低3 000。

溶液的制備：(1)混合對照品溶液的制備。取厚樸酚對照品與和厚樸酚對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含30μg的厚樸酚與10μg的和厚樸酚混合對照品溶液,即得。(2)供試品溶液的制備。取本品1.0 g,精密稱定,精密加入70%甲醇10 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率500 W,頻率40 k Hz)30 min,取出,放冷,再稱重,用70%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過(0.45μm的微孔濾膜),取續(xù)濾液,即得。(3)陰性對照溶液的制備。照半夏厚樸湯標準湯劑制備方法,同法制備缺厚樸飲片的陰性樣品,再按“2.3.2”項下供試品溶液的制備方法,同法制備厚樸陰性對照溶液。

2.3.3 方法學考察 (1)專屬性試驗。分別取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10μL,按“2.3.2”項下色譜條件分別進樣檢測,記錄其色譜,結(jié)果見圖4。結(jié)果表明,陰性對檢測結(jié)果無干擾,提示專屬性良好。

圖4 專屬性色譜

(2)線性關(guān)系考察。分別精密量取“2.3.2”項下的混合對照品分別用甲醇稀釋0、2、5、10、20、50、100倍,按“2.3.2”項下的色譜條件進樣測定,記錄峰面積。以厚樸酚、和厚樸酚對照品濃度X(mg/mL)為橫坐標,以峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線,并進行線性回歸,得厚樸酚的回歸方程為Y＝15 411X＋15 915,相關(guān)系R2＝0.999 5,表明厚樸酚在0.2～17.1μg的含量范圍內(nèi)線性良好；和厚樸酚的回歸方程為Y＝15 495X＋331 925,相關(guān)系數(shù)R2＝0.999,表明和厚樸酚在0.2～19.7μg的含量范圍內(nèi)線性良好。

(3)精密度試驗。取半夏厚樸湯標準湯劑(批號：BTD20180815)供試品約1.0 g,精密稱定,按供試品溶液制備項下制備樣品溶液,精密吸取供試品溶液10μL,連續(xù)進樣6次,再按上述色譜條件連續(xù)進樣測定,記錄峰面積。結(jié)果厚樸酚、和厚樸酚的峰面積RSD分別為0.13%、0.16%,表明儀器精密度良好。

(4)穩(wěn)定性試驗。取同一批半夏厚樸湯標準湯劑(批號：BTD20180815)供試品溶液,分別于0、2、4、6、8、12、24小時進樣測定,記錄色譜峰峰面積。結(jié)果表明,厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD分別為0.66%,0.57%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定良好。

(5)重復(fù)性試驗。取同一批半夏厚樸湯標準湯劑(批號：BTD20180815),按“2.3.2”項下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液,進樣測定。計算6份供試品中厚樸酚與和厚樸酚的含量,結(jié)果表明,樣品中厚樸酚、和厚樸酚的平均含量分別為0.097%、0.060%,RSD分別為0.36%、0.34%,表明本方法的重復(fù)性良好。

(6)加樣回收率試驗。取同一批半夏厚樸湯標準湯劑(批號：BTD20180815)供試品約0.5 mg,共6份,精密稱定,分別向其中加入厚樸酚對照品0.48 mg與和厚樸酚0.30mg,按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液,進樣測定,計算厚樸酚與和厚樸酚的平均加樣回收率。結(jié)果表明,厚樸酚、和厚樸酚平均回收率分別為106.36%,102.85%,RSD分別為3.91%、3.50%。

(7)樣品含量測定。取10批半夏厚樸湯標準湯劑凍干粉,按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.3.2”項下色譜條件測定厚樸酚與和厚樸酚的含量,并計算其總轉(zhuǎn)移率,見表1。結(jié)果表明,10批標準湯劑的出膏率為11.25%～12.95%,平均值為11.80%；厚樸酚和和厚樸酚的總轉(zhuǎn)移率為4.74%～5.62%,平均值為5.45%。

表1 半夏厚樸湯標準湯劑含量測定結(jié)果 (%)

3 討論

3.1 制備工藝

半夏厚樸湯古方記載[13]制法“以水七升,煮取四升,分溫四服,日三夜一服”,本研究分別采用原方原工藝及《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》對半夏厚樸湯標準湯劑進行工藝研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),以原方工藝進行其煎煮時間過短不符合現(xiàn)代臨床煎藥習慣,故本研究最終以《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》為煎煮工藝研究依據(jù)。即選取合格單味飲片,以水為提取溶劑,照臨床湯劑煎煮方法規(guī)范化煎煮,經(jīng)固液分離,低溫減壓濃縮,冷凍干燥后制得。

3.2 薄層鑒別

經(jīng)研究建立方中厚樸、紫蘇葉、生姜TLC方法且專屬性良好。此外,本研究曾嘗試對處方半夏中的氨基酸類成分、生物堿類成分、有機酸類成分以及茯苓中的三萜類成分進行薄層鑒別方法建立,但經(jīng)過更換供試品制備方式、展開條件、顯色劑種類等方法其結(jié)果均顯示陰性干擾,故未將半夏和茯苓二者納入質(zhì)量標準。

3.3 含量測定

研究表明[14-15],厚樸酚與和厚樸酚為半夏厚樸湯的主要藥效成分,故本研究以厚樸酚與和厚樸酚為指標建立含量測定方法,以控制本品的質(zhì)量。本研究通過考察色譜條件及供試品制備方式,確定最佳色譜條件且方法驗證符合含量測定要求。此外,本研究曾嘗試采用HPLC法建立方中君藥半夏中生物堿及琥珀酸的含量測定方法,但結(jié)果均不符合HPLC測定要求,故未將君藥半夏的HPLC含量測定方法納入半夏厚樸湯標準湯劑的質(zhì)量標準。