消栓健腦沖劑對(duì)大鼠腦缺血模型的保護(hù)作用及機(jī)制研究

孫麗娜,廉治軍

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 研究生學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng)110847；2.大連皮膚病醫(yī)院,遼寧 大連116021)

腦缺血病是指血管破損或堵塞而引起腦組織缺血缺氧,從而導(dǎo)致腦組損傷的臨床疾病,又稱中風(fēng),分缺血性和出血性腦缺血[1]。當(dāng)腦組織出現(xiàn)缺血缺氧時(shí)導(dǎo)致腦細(xì)胞死亡,輕則損傷神經(jīng)功能,引起知覺、感覺的喪失,重則引起癱瘓、死亡,該病已經(jīng)成為威脅人類健康的危急疾病。中醫(yī)藥在防治腦缺血病中有特殊優(yōu)勢(shì),本次實(shí)驗(yàn)主要觀察消栓健腦沖劑大鼠腦缺血模型腦梗死面積和腦含水量的作用,探討其對(duì)腦組織的保護(hù)作用及作用機(jī)制,為中醫(yī)藥防治腦缺血病提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與用藥

本次研究使用SD雌性大鼠9只,6～8周齡,體重260±20g。

消栓健腦沖劑的制備：按大鼠等效劑量相當(dāng)于人的6.3倍計(jì)算,大鼠100g/d用藥量為[2]：當(dāng)歸0.63g、黃芪0.63g、刺五加0.63g、伸筋草0.315 g、姜黃0.315 g、紅花0.315 g、川芎0.63g,將顆粒藥物加20mL水,混合備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器與試劑如表1、表2所示。

表1 實(shí)驗(yàn)所用主要儀器

表2 主要試劑及其生產(chǎn)公司

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組與建立模型

將9只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和實(shí)驗(yàn)組。將模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠用10%水合氯醛按3.5 mL/kg腹腔注射麻醉后,仰臥安置于手術(shù)臺(tái),頸正中偏右切口,分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈,結(jié)扎頸外動(dòng)脈及其分支,于頸總動(dòng)脈近心端處用針頭穿刺一小口,由此處輕輕插入準(zhǔn)備好的魚線,平均深度為22.0±2.0mm。魚線從頸總動(dòng)脈插入經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈分叉輕輕進(jìn)入顱內(nèi)至大腦前動(dòng)脈,其深度恰好阻斷大腦中動(dòng)脈血流,固定魚線,打開頸外動(dòng)脈分支,縫合頸部皮膚?？瞻捉M大鼠頸正中偏右切口后縫合頸部皮膚[3]。

2.2 給藥方法

按大鼠胃容量0.875mL/100g,連續(xù)灌胃14d,3次/d。模型組大鼠給生理鹽水,實(shí)驗(yàn)組大鼠按0.4g/kg給消栓健腦沖劑,空白組不做處理。14d后麻醉各組大鼠后,分離腦組織。

2.3 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法

2.3.1 TTC染色檢測(cè)腦梗死體積方法 將大鼠腦組織用生理鹽水沖洗干凈后,至于－20℃冷凍30 min左右,30min后把腦組織放置于冰盒上,將整個(gè)腦(右側(cè)蒼白區(qū)域)冠狀切成1mm厚的薄片5片(肉眼觀察整個(gè)腦,右側(cè)梗死部位比其他部位蒼白),將5片薄片放入1%TTC染液中(PBS配制,注意避光),37℃染15 min,期間不斷翻動(dòng)切片,保證切片均勻著色。著色均勻后用數(shù)碼相機(jī)照相,并用軟件計(jì)算梗死面積百分比。

2.3.2 測(cè)定大腦含水量方法 切除大鼠小腦與左腦,用濾紙將血吸干后稱取右側(cè)大腦濕重,然后將右腦置于培養(yǎng)皿中,置于恒溫培養(yǎng)箱中烘干72 h,至右腦完全烘干、最后稱取大腦干重,測(cè)定大腦含水量：腦含水量(%)＝(濕重－干重)/濕重×100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料以(±s)表示,組間以t檢驗(yàn)和單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 TTC染色檢測(cè)腦梗死面積結(jié)果

大鼠腦梗死面積比較：空白組大鼠雙側(cè)腦組織均紅染,無(wú)梗死面積,與空白組比較,模型組和實(shí)驗(yàn)組腦梗死面積明顯增大(P＜0.01)；與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組腦梗死比較明顯減少(P＜0.01),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明消栓健腦沖劑能夠明顯減少腦組織梗死面積,起到保護(hù)腦組織的作用見。見表3、圖1。

表3 各組大鼠腦梗死面積結(jié)果比較 (±s,%)

表3 各組大鼠腦梗死面積結(jié)果比較 (±s,%)

注：與空白組比較,?、＃P＜0.01；與?比較,＃＜0.01。

組別 梗死面積空白組 0模型組 45.24±0.48?實(shí)驗(yàn)組 34.21±0.79＃

圖1 各組大鼠腦梗死面積比較

3.2 測(cè)定大腦含水量結(jié)果

大腦濕重比較,與空白組比較,模型組和實(shí)驗(yàn)組大腦濕重均明顯降低(P＜0.05)；與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組大腦濕重明顯降低(P＜0.05)。大腦干重比較,與空白組比較,模型組明顯降低(P＜0.01),實(shí)驗(yàn)組無(wú)差異(P＞0.05),與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組大腦濕重明顯降低(P＜0.01)。大腦含水量比較,與空白組比較,模型組明顯降低(P＜0.05),實(shí)驗(yàn)組無(wú)差異(P＞0.05),與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組大腦濕重明顯降低(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明消栓健腦沖劑能夠明顯抑制腦缺血后腦水腫的發(fā)生和發(fā)展。

表4 各組大鼠腦含水量結(jié)果比較 (±s)

表4 各組大鼠腦含水量結(jié)果比較 (±s)

注：與▽比較,?、＃P＜0.05,與? 比較,＃P＜0.05；與▽▽比較,??P＜0.01,＃＃P＞0.05,與??比較,＃＃P＜0.01；與▽▽▽比較,△P＜0.05,▲P＞0.05,與△比較,▲P＜0.05。

組別 濕重(g) 干重(g) 含水量(%)空白組 0.720±0.232▽ 0.167±0.242▽▽ 76.81±0.210▽▽▽模型組 0.672±0.531? 0.137±0.651?? 79.61±0.556△實(shí)驗(yàn)組 0.692±0.126＃ 0.160±0.351＃＃ 76.88±0.326▲

4 討論

腦梗死面積評(píng)價(jià)是判定腦梗缺血、腦梗死程度和預(yù)后最直接的方法。TTC是檢測(cè)腦缺血常用的方法,TTC是呼吸鏈中吡啶－核苷結(jié)構(gòu)酶系的質(zhì)子受體,為脂溶性光敏復(fù)合物,能夠通過氧化酶系反應(yīng),將正常的腦組織由無(wú)色染為紅色,而缺血梗死的腦組織酶活性降低,不能誘導(dǎo)其發(fā)生染色反應(yīng)而為白色,因此,通過TTC染色反應(yīng)可以觀察腦組織中正常和損傷、壞死部分[4]。本次研究中空白組腦組織雙側(cè)半球均為均一色紅染,無(wú)梗死灶；模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織梗死面積較空白組明顯增大,變成均出現(xiàn)不同程度的腦梗死(P＜0.01),而實(shí)驗(yàn)組大鼠腦梗死面積較模型組明顯減少(P＜0.01),說明消栓健腦沖劑能夠明顯抑制腦細(xì)胞、腦神經(jīng)損傷,對(duì)腦組織起到明顯的保護(hù)作用。

腦水腫即體液異常聚集于腦實(shí)質(zhì)中,引起腦細(xì)胞、組織腫脹,是腦缺血病常見的病理變化之一,能夠嚴(yán)重影響腦神經(jīng)的功能和修復(fù),嚴(yán)重威脅生命健康安全[5]。腦水腫主要是因?yàn)槟X細(xì)胞和腦組織出現(xiàn)缺血后,血腦屏障被損壞,血漿從腦血管滲透到細(xì)胞外間隙引發(fā)水腫。腦含水量的測(cè)定可以反應(yīng)腦水腫的程度,本次研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腦水腫程度要明顯高于空白組和實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05),表明模型組大鼠腦組織存在明顯的水腫,而實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織含水量和空白組沒有明顯差異(P＞0.05),結(jié)果說明消栓健腦沖劑能夠明顯消除腦組織水腫,保護(hù)腦細(xì)胞和腦組織。

本次研究表明消栓健腦沖劑對(duì)大鼠模型的腦組織起到明顯的保護(hù)作用,其組成為：當(dāng)歸、黃芪、紅花、川芎、刺五加、伸筋草、姜黃,方中當(dāng)歸補(bǔ)血活血,祛瘀而不傷血；黃芪健脾補(bǔ)氣,氣血化生有源,血隨氣行,祛瘀活血而不傷正氣,二者共為君藥；紅花、川芎二藥行氣補(bǔ)血,活血化瘀,助黃芪補(bǔ)氣行氣之功、當(dāng)歸補(bǔ)血活血化瘀之效；佐藥刺五加、伸筋草活血脈,活血通絡(luò),祛瘀止痛；姜黃破血行氣、通經(jīng)止痛,善引藥上行,為使藥,諸藥合用共行補(bǔ)氣行氣、活血化瘀之功。

腦缺血病的發(fā)病和治療機(jī)制、過程很復(fù)雜,本次實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠腦缺血模型,觀察消栓健腦沖劑對(duì)大鼠腦組織梗死、缺血面積和腦含水量的影響,結(jié)果表明消栓健腦沖劑能夠改善大鼠腦組織損傷狀態(tài),為下一步研究奠定基礎(chǔ)。