超聲波-酶法提取油茶多酚的工藝研究

高群，張智，楊可心，魏罡，呂歌，楊柳

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱150040)

油茶是山茶科山茶屬的多年生木本油料作物，與橄欖、油棕和椰子并稱為世界四大木本食用油料樹種，是我國最重要的食用油料樹種之一[1]。油茶粕年平均產(chǎn)量約為63.98萬t，除了部分用作飼料以外，其余都當(dāng)做廢棄物處理，造成了資源的極大浪費(fèi)。實(shí)際上，油茶粕具有很高的應(yīng)用價值，能廣泛應(yīng)用于食品、飼料、農(nóng)藥等領(lǐng)域[2]，多酚是油茶中最重要且分布最廣泛的次生代謝產(chǎn)物之一，具有天然的抑菌、抗氧化、抗腫瘤、降血糖等功能[3]。

采用超聲波提取法和酶提取法從植物中提取多酚的研究國內(nèi)外已有較多報道[4-10]，也有采用超聲波輔助酶法從紅松樹皮、花生殼、柚葉等材料中提取多酚[11-13]，但以超聲波輔助復(fù)合酶酶法提取油茶多酚的研究鮮見報道。

本研究采用超聲波輔助復(fù)合酶酶法提取油茶多酚，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多酚得率為評價指標(biāo)，利用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，為油茶多酚類化合物的研究及開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶粕，重慶秀山提供；沒食子酸，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；纖維素酶(1.4×106U/g)和果膠酶(1.0×105U/g)，北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.2 設(shè)備

TD5001C型電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DL-6M型離心機(jī)，湖南星科科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理。將油茶粕粉碎成粉末，過80目篩，置于干燥箱備用。

1.3.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。配制濃度為1000 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于100 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，濃度分別為10、20、30、40、50 μg/mL。分別移取不同濃度的沒食子酸溶液各1 mL于試管內(nèi)，加入5.0 mL 10%的福林酚試劑，搖勻，反應(yīng)3～8 min，然后加入4.0 mL 7.5%的碳酸鈉溶液，搖勻，室溫避光放置60 min，在765 nm波長條件下測定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 油茶粕中多酚含量的測定。吸取1 mL多酚提取液，加入5.0 mL 10%的福林酚試劑，搖勻，反應(yīng)3～8 min，然后加入4.0 mL 7.5%的碳酸鈉溶液，搖勻，室溫避光放置60 min，在765 nm波長條件下測定吸光值，按下式計算樣品中的多酚得率。

A=(C×V×N)/M

式中，A為多酚得率(mg/g)；C為沒食子酸濃度(μg/mL)；V為提取液體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量(g)。

1.3.4 油茶多酚的提取工藝流程

油茶粕→加入酶進(jìn)行酶解處理→滅酶→超聲波乙醇溶液萃取→離心→取上清液→濃縮→冷凍干燥→成品

1.3.5 單因素試驗(yàn)。稱取1.0 g油茶粕放入三角瓶中，分別考察復(fù)合酶(纖維素酶和果膠酶)的比例(1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、乙醇濃度(40%、45%、50%、55%、60%、65%)、溫度(40、45、50、55、60 ℃)、時間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)對多酚得率的影響。

1.3.6 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

試驗(yàn)采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，水平因素安排見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，回歸方程為Y=0.1071X+0.0215，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994，沒食子酸質(zhì)量濃度在1～5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 提取工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同酶比例的試驗(yàn)

圖2 加酶比對多酚得率的影響

由圖2可知，在纖維素酶和果膠酶的添加比例為1∶2時，多酚得率達(dá)到最大值(18.98 mg/g)，之后呈下降趨勢。綜合考慮，選擇加酶比1∶1、1∶2、2∶1作響應(yīng)面分析。

2.2.2 不同料液比的試驗(yàn)

圖3 料液比對多酚得率的影響

由圖3可知，在料液比為1∶25(g/mL)時，多酚得率達(dá)到最大值(18.64 mg/g)，之后呈下降趨勢。綜合考慮，選擇料液比1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)作響應(yīng)面分析。

2.2.3 不同乙醇濃度的試驗(yàn)

圖4 乙醇濃度對多酚得率的影響

由圖4可知，當(dāng)乙醇濃度在40%～55%時，多酚得率隨著乙醇濃度的增大呈上升趨勢，并在55%時，多酚得率達(dá)到最大值(15.92 mg/g)，之后，多酚得率逐漸下降。綜合考慮，選擇乙醇濃度55%較為合適。

2.2.4 不同溫度的試驗(yàn)

圖5 溫度對多酚得率的影響

由圖5可知，當(dāng)溫度在40～50 ℃時，隨著溫度的升高，多酚得率呈上升趨勢，并在50 ℃時，多酚得率達(dá)到最大值(16.41 mg/g)，之后，隨著溫度的升高，多酚得率逐漸減小。綜合考慮，選擇溫度50 ℃較為合適。

2.2.5 不同提取時間的試驗(yàn)

圖6 時間對多酚得率的影響

由圖6可知，當(dāng)時間在0.5～1.0 h時，隨著時間的延長，多酚得率呈上升趨勢，并在1.0 h時，多酚得率達(dá)到最大值(16.41 mg/g)，之后，隨著時間的延長，多酚得率逐漸減小。綜合考慮，選擇時間0.5、1.0、1.5 h作響應(yīng)面分析。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，選取對多酚得率影響較大的因素，加酶比、時間、料液比3個因素作為自變量，以多酚得率為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn)，運(yùn)用 Design-Expert 軟件，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理，設(shè)計如下17組試驗(yàn)，結(jié)果見表2所示。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果

對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到的回歸方程為：

R=19.27-0.27A+0.82B-0.53C-0.17AB+0.22AC+0.14BC-1.48A2-1.91B2-0.57C2

模型回歸方程方差分析結(jié)果見表3所示。

由表3可知，整體模型的“Prob>F”值<0.0001，表明該模型極為顯著，失擬項(xiàng)的“Prob>F”值為0.5910(>0.05)，則表明該項(xiàng)不顯著，模型是合適的，相關(guān)系數(shù)R2=0.9848，表明該擬合模型可以表示98.48%多酚得率的變化情況，因此，該模型擬合良好，用它確定油茶多酚提取的最佳工藝條件是合適的。同時，由F值的大小可知，各因素對多酚得率影響的大小順序?yàn)椋簳r間(B)>料液比(C)>加酶比(A)。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析

2.4 各因素交互作用對多酚得率的影響

圖7 各因素的交互作用對油茶多酚得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

從圖7中可以直觀的分析出各試驗(yàn)因素之間的相互作用對響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面圖形傾斜度越高，等高線圖形越橢圓，表明交互作用越顯著，反之則相反[14]。由圖7可知，時間(B)和料液比(C)之間的交互作用對油茶多酚得率的影響最為顯著。

2.5 油茶多酚提取工藝條件的優(yōu)化與驗(yàn)證

綜合以上可以得出，由上述響應(yīng)面回歸模型預(yù)測的油茶多酚最佳提取工藝條件為：加酶比1∶2、時間0.85 h、料液比1∶22.5(g/mL)，在此條件下油茶多酚含量的理論值為18.56 mg/g。為了操作方便，將上述響應(yīng)面模型預(yù)測的最佳條件修改為：加酶比1∶2、時間0.85 h、料液比1∶23(g/mL)，在此條件下油茶多酚含量的實(shí)際值為18.94 mg/g。相對誤差為2%，理論值與實(shí)際值相對誤差較小，表明該模型是合理的，可以用其來作為油茶多酚提取的最佳工藝條件。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法對油茶多酚提取的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，通過優(yōu)化所得油茶多酚的最佳提取工藝條件為：加酶比1∶2、料液比1∶23(g/mL)、乙醇濃度55%、溫度50 ℃、時間0.85 h，在此條件下油茶多酚含量的實(shí)際值為18.94 mg/g。與理論值相比偏差較小，相對誤差為2%，表明該模型是合理的，可以用其來作為油茶多酚提取的最佳工藝條件。