抗肉桂醛益生菌的篩選、鑒定和益生特性評(píng)價(jià)

蔣溥 王競(jìng)?cè)? 王慶奎 謝體彪 劉桐 朱鵬錦 王洋

摘要：為了篩選適合添加于含肉桂醛飼料的水產(chǎn)益生菌，從飼喂肉桂醛的半滑舌鰨腸道中篩選5株芽孢桿菌，同時(shí)選用筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的35株潛在益生菌，以定性定量法篩選具有高水解酶活性且抗肉桂醛的菌株并鑒定。通過福林-酚法、3，5-二硝基水楊酸法定量測(cè)定各菌株的蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶活性;進(jìn)一步以生長(zhǎng)抑制法確定各菌株耐受肉桂醛的能力，以16S rDNA序列鑒定優(yōu)勢(shì)菌株。結(jié)果表明，9種芽孢桿菌具有較強(qiáng)的益生特性，其中菌株 1-D 的蛋白酶活性最強(qiáng)，為（10.137±0.046） U/mL，菌株8-D的淀粉酶活性最強(qiáng)，為（5.739±0.018） U/mL，菌株 9-D 的纖維素酶活性最強(qiáng)，為（63.436±0.006） U/mL，且這9株菌分別屬于枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，最高能夠耐受濃度為 2.5 μmol/mL 的肉桂醛。研究篩選的菌株，有作為益生菌應(yīng)用于含肉桂醛飼料的潛力。

關(guān)鍵詞：肉桂醛;芽孢桿菌;篩選鑒定;益生菌;益生特性

中圖分類號(hào)： S182

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）15-0200-05

肉桂醛（三苯基丙稀醛）具有防腐殺菌[1-2]、抗炎[3]、抗癌[4]等作用，作為抗生素替代物，已被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中[5]。近年來，肉桂醛在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用也取得了理想的效果。然而，由于肉桂醛對(duì)各類微生物具有廣譜抑制能力[6]，在對(duì)抗病原菌的同時(shí)，也會(huì)降低益生菌的數(shù)量[7]，因此可能影響腸道菌群平衡。但也有報(bào)道認(rèn)為，肉桂醛可促進(jìn)有益菌的增殖，改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率及肉雞的免疫力[8]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加了肉桂醛后改變了半滑舌鰨的腸道菌群結(jié)構(gòu)，降低了部分益生菌的比例。

水產(chǎn)益生菌是通過人為篩選擴(kuò)增，添加于水產(chǎn)飼料或水體中，以改善水產(chǎn)品健康狀態(tài)的微生態(tài)制劑。目前，已知的水產(chǎn)益生菌主要有乳酸菌[7]、芽孢桿菌[9]、酵母菌[10]、光合細(xì)菌、放線菌等。芽孢桿菌作為目前應(yīng)用范圍最廣的益生菌，其作用機(jī)制多種多樣，包括分泌消化酶類、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和位點(diǎn)、影響免疫系統(tǒng)、調(diào)節(jié)過敏反應(yīng)等。尤其是芽孢桿菌能夠提高水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)飼料中碳水化合物[11]、蛋白質(zhì)和脂肪[12]的利用率，顯著改善水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[13]。本研究擬從益生芽孢桿菌中篩選出具有高產(chǎn)消化酶活性，且對(duì)低濃度肉桂醛具有一定抗性的益生菌，為益生菌與肉桂醛的聯(lián)合應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 芽孢桿菌菌種 芽孢桿菌菌株40株（其中5株分離自飼喂肉桂醛飼料的半滑舌鰨腸道，其余分離自各種生境），保藏于天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 肉桂醛[含量≥95%，酸值≤3 mg/g（以KOH計(jì)），相對(duì)密度1.047～1.051，折光率1.618～1.623]，購(gòu)于上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司。

吐溫80、乙酸乙酯、無水乙醇、酪氨酸、麥芽糖、葡萄糖均為分析純，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

LB培養(yǎng)基配方（1 L溶液中）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 SHP-250型微生物生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-1D型凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司;MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋，日本Sanyo公司;HZQ-F160全溫?fù)u床，哈爾濱東聯(lián)電子科技開發(fā)有限公司;UV-3000雙光束分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.2 芽孢桿菌產(chǎn)酶活性的定性定量測(cè)定

1.2.1 酶活性的定性檢測(cè) （1）蛋白酶活性定性測(cè)定。配制產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨5.0 g，酵母浸粉25.0 g，磷酸氫二鉀0.3 g，七水合硫酸鎂0.5 g，氯化鈉1.0 g，瓊脂 20.0 g，加水800 mL，pH值6.8～7.2，121 ℃ 15 min;脫脂乳200 mL（按8.4 g定容至100 mL的比例配制，氮含量相當(dāng)于原奶，代替酪蛋白）110 ℃ 20 min。以產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基制備平板，在平板上點(diǎn)種0.5 μL芽孢桿菌菌液，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h后，以游標(biāo)卡尺測(cè)定透明圈直徑和菌落直徑。

（2）淀粉酶活性定性測(cè)定。配制產(chǎn)淀粉酶培養(yǎng)基（1 L）：可溶性淀粉10 g，酵母浸粉25 g，磷酸氫二鉀0.3 g，七水合硫酸鎂0.5 g，氯化鈉1 g，瓊脂20 g，pH值自然。操作方法：以產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基制備平板，在平板上點(diǎn)種0.5 μL芽孢桿菌菌液，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h后加入稀釋100倍的盧戈氏碘液，以游標(biāo)卡尺測(cè)定透明圈直徑和菌落直徑。

（3）纖維素酶活性定性測(cè)定。配制產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨10 g，酵母浸粉10 g，羧甲基纖維素鈉10 g，氯化鈉 5 g，磷酸氫二鉀1 g，瓊脂20 g，pH值自然。以產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基制備平板，在平板上點(diǎn)種0.5 μL芽孢桿菌菌液，37 ℃倒置培養(yǎng)36～48 h后倒入1 mg/mL剛果紅染色劑染色1 h，之后用1 mol/L氯化鈉溶液浸泡15 min，以游標(biāo)卡尺測(cè)定透明圈直徑和菌落直徑。

1.2.2 酶活性的定量檢測(cè) 菌株在LB培養(yǎng)基中（37 ℃）培養(yǎng)12 h后，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心（8 000 r/min、1 min），取其上清液，通過福林-酚法[14]對(duì)蛋白酶進(jìn)行定量檢測(cè)，通過3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[15]對(duì)淀粉酶進(jìn)行定量檢測(cè)。通過DNS法[16]對(duì)纖維素酶進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.3 高產(chǎn)酶活芽孢桿菌抗肉桂醛特性

收集各菌株的對(duì)數(shù)期菌體（培養(yǎng)8 h為對(duì)數(shù)期菌體），分別接種至LB液體培養(yǎng)基中搖勻，使得最初活菌數(shù)約為 107 CFU/mL（1%接種量）。

配制1 mmol/mL肉桂醛（摩爾質(zhì)量為132.16 g/mol）溶液：稱取純度為100%的肉桂醛1.321 6 g，加入10 mL吐溫的乳化體系[17]（吐溫80、乙酸乙酯、無水乙醇質(zhì)量分別為 1.321 6、0.660 8、0.660 8 g），乳化均勻。配制系列肉桂醛稀釋溶液，濃度分別為1、10、25、50 μmol/mL。同時(shí)以相同方法制備不含肉桂醛的溶液，作為溶劑對(duì)照。

將上述菌液用LB培養(yǎng)基使活菌數(shù)稀釋到約為 106 CFU/mL，無菌操作下（全程在超凈臺(tái)中）加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔90 μL。加入濃度分別為1、10、25、50 μmol/mL的肉桂醛溶液10 μL，使菌液中肉桂醛的濃度分別為0.1、1、2.5、5 μmol/mL，另外設(shè)置陰性對(duì)照組（僅菌液+不含肉桂醛的溶液）、陽(yáng)性對(duì)照組（僅LB培養(yǎng)基+不含有肉桂醛的溶液），每株菌設(shè)置3個(gè)平行。

將96孔板小心平放至37 ℃培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)12 h，取出用酶標(biāo)儀測(cè)定D600 nm。根據(jù)D600 nm下降情況，判斷菌株對(duì)肉桂醛的耐受濃度。

1.4 高產(chǎn)酶活芽孢桿菌的鑒定

通過篩選獲得高酶活菌株，測(cè)定16S rDNA的序列，確定其分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活性的定性測(cè)定

從實(shí)驗(yàn)室保存的益生菌資源中，篩選蛋白酶活性高的芽孢桿菌菌株。由表1可知，所測(cè)試的40株芽孢桿菌中，22株菌在蛋白酶培養(yǎng)基上產(chǎn)生了明顯的溶解圈，其中6株菌的蛋白酶溶解圈直徑與菌落直徑比值達(dá)到了1.5～2.5，其余16株菌的蛋白酶溶解圈直徑與菌落直徑比值為1.0～1.5。蛋白酶活性最高的3株芽孢桿菌編號(hào)分別為3-D、34-D和 14-D。菌株3-D的溶解圈直徑與菌落直徑比值最大，達(dá)230±0.20。據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌蛋白酶溶解圈直徑與菌落直徑比值達(dá)到2.00～3.00[18]，即表明菌株產(chǎn)蛋白酶的能力較強(qiáng)，提示菌株3-D屬于高蛋白酶活性菌株。在應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖時(shí)，芽孢桿菌可直接分泌蛋白酶，提高飼料的降解和吸收，并起到凈水肥水的功效[19]。因此，本研究篩選得到的高蛋白酶活性菌株，應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖可能有利于降低餌料系數(shù)，改善養(yǎng)殖水質(zhì)。

淀粉是水產(chǎn)飼料中重要的能量物質(zhì)之一，因此具有高淀粉酶活性的菌株，有利于提高水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)飼料中淀粉的利用效率。由表2可知38株潛在益生芽孢桿菌的淀粉酶活性，其中13株菌的淀粉酶溶解圈直徑與菌落直徑比值為1.5～25，其余25株菌的淀粉酶溶解圈直徑與菌落直徑比值為 0.9～1.5。淀粉酶活性最高的3株編號(hào)分別為 7-D、8-D和5-D。菌株7-D的溶解圈直徑與菌落直徑比值最大，為2.05。與其他文獻(xiàn)中報(bào)道的高產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌活性相似[20]。產(chǎn)淀粉酶益生菌對(duì)中華絨螯蟹生長(zhǎng)性能和腸道消化酶活性有不同程度的促進(jìn)作用，中、低劑量活菌不僅能顯著提高水產(chǎn)動(dòng)物的增質(zhì)量率、腸道淀粉酶和蛋白酶活性，還能提高水產(chǎn)動(dòng)物的免疫力和抗病力，這可能與菌株所發(fā)揮的其他益生功能有關(guān)[21]。

表3中列出了所有芽孢桿菌中纖維素酶活性較高的32株菌，其中15株菌的纖維素酶溶解圈直徑與菌落直徑比值在 2～4間，17株菌的纖維素酶溶解圈直徑與菌落直徑比值在 1～2 間。纖維素酶活性最高的3株芽孢桿菌分別為 6-D、1-D 和9-D。菌株6-D的溶解圈直徑與菌落直徑比值達(dá)到了3.88±0.30，顯著高于其他文獻(xiàn)中報(bào)道的數(shù)值 2.277±0.109 8[22]，表明本研究的菌株屬于高產(chǎn)纖維素的菌株。纖維素酶可特異性地降解纖維素，從而提高禽類對(duì)飼料中粗纖維的消化率[23]。在基礎(chǔ)日糧中添加0.05%、0.10%、0.20%纖維素酶，鯉魚的增質(zhì)量率較對(duì)照組分別提高了32.97%、39.11%和37.70%，餌料系數(shù)分別降低了 8.28%、8.88%和8.88%， 與對(duì)照組差異顯著 （P<0.05）[24]， 說明纖維素酶能

促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物腸道蠕動(dòng)，刺激內(nèi)源消化酶分泌，提高水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率，提升水產(chǎn)動(dòng)物的健康狀態(tài)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 酶活性的定量測(cè)定

綜合蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶定性結(jié)果，選取酶活性較高的9株菌（1-D，2-D，3-D，4-D，5-D，6-D，7-D，8-D，9-D），定量測(cè)定其酶活性。由圖1可知，其中菌株1-D和2-D的酶活性最強(qiáng)，依次為（10.137±0.046）、（9.66±0.022） U/mL。其余菌株活性為（6.028±0.018）～（0.396±0.006） U/mL。其他文獻(xiàn)中報(bào)道，枯草芽孢桿菌BY7的蛋白酶活性可達(dá)到43.28 U/mL[19]?？梢姳狙芯恐械木甑鞍酌富钚圆⒉桓?，可能與菌株培養(yǎng)基的差異有關(guān)。蛋白質(zhì)是水產(chǎn)動(dòng)物飼料中最重要的成分之一，然而飼料中蛋白質(zhì)的利用率卻很低，造成了極大的浪費(fèi)。且未被消化利用的蛋白質(zhì)隨著糞便排放到水體中，造成了水質(zhì)劣化，危害了水產(chǎn)動(dòng)物的健康[25]。有許多研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)蛋白酶的益生菌有利于提高水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)飼料中干物質(zhì)、粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率[26]，從而降低養(yǎng)殖成本，并且改善水質(zhì)，符合健康生態(tài)養(yǎng)殖的理念。

由圖2可知9株芽孢桿菌在LB培養(yǎng)基中的胞外淀粉酶活性，其中菌株8-D和4-D酶活性最強(qiáng)，依次為（5.739±0.018）、（5.416±0.009） U/mL。其余菌株活性為（4.823±0.027）～（1.163±0.001） U/mL。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，高產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌在淀粉搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，胞外淀粉酶活性可達(dá)到2.01 U/mL[15]?？梢姳狙芯恐芯?-D和 4-D 酶活性較高。補(bǔ)充產(chǎn)胞外淀粉酶的芽孢桿菌，可以提高水產(chǎn)品消化道的淀粉酶活性，促進(jìn)魚體生長(zhǎng)[27]。因此，本研究中菌株8-D和4-D可能具有促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)的功效。

由圖3可知，其中菌株9-D和5-D酶活性最強(qiáng)，依次為（63.436±0.006）、（61.887±0.002） U/mL。其余菌株活力為（30.225±0.005）～（17.272±0.003） U/mL。與其他報(bào)道相比，本研究的芽孢桿菌纖維素酶活性屬于中等水平。據(jù)報(bào)道，高產(chǎn)纖維素的枯草芽孢桿菌Pab02纖維素酶活性高達(dá) 358.751 U/mL[28]。纖維素在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的比例并不高，但對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)和腸道調(diào)節(jié)作用不容忽視。益生菌在合成蛋白酶、淀粉酶的同時(shí)，還能產(chǎn)生纖維素酶，有利于降解飼料原料中的纖維素，促進(jìn)水生動(dòng)物對(duì)纖維素來源糖類物質(zhì)的吸收利用。同時(shí)改善纖維素的狀態(tài)，可能有利于腸道菌群平衡。

2.3 高產(chǎn)酶活芽孢桿菌抗肉桂醛特性

為了評(píng)價(jià)本研究所篩選的益生菌是否適用于含肉桂醛水產(chǎn)飼料，采用生長(zhǎng)抑制法測(cè)定9株益生菌的肉桂醛耐受力。由圖4可知，各益生菌在含有肉桂醛的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)12 h后，光密度與肉桂醛濃度呈線性負(fù)相關(guān)，r2均在0.98以上。

建立光照度與肉桂醛濃度的線性方程，計(jì)算各菌株在肉桂醛含量為2.5 μmol/mL（330.4 μg/mL）時(shí)的敏感性，菌株 9-D對(duì)肉桂醛最敏感，在2.5 μmol/mL濃度下D600 nm降低了51.30%，相比之下，菌株7-D在同樣濃度的肉桂醛處理下最不敏感，菌體濃度僅下降了27.03%（其他芽孢桿菌D600 nm下降率分別為1-D 36.29%、2-D 31.76%、3-D 58.09%、5-D 48.78%、6-D 49.66%、8-D 40.96%、9-D 5130%）。另根據(jù)方程推算半數(shù)抑制濃度（D600 nm降低到不含肉桂醛時(shí)的50%），各菌株對(duì)肉桂醛的半數(shù)抑制濃度從高到低依次為8-D 0.222 2 μmol/mL、7-D 0.202 6 μmol/mL、5-D 0.176 1 μmol/mL、9-D 0.171 6 μmol/mL、4-D 0.167 5 μmol/mL、3-D 0.158 5 μmol/mL、2-D 0.142 1 μmol/mL、1-D 0.141 9 μmol/mL、6-D 0.123 4 μmol/mL。肉桂醛對(duì)多種細(xì)菌有抑制作用，但對(duì)不同種的菌抑制效果不同。據(jù)報(bào)道，肉桂醛能抑制人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)-549細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴性，IC50值為 2.72 μmol/mL[29]。還有報(bào)道顯示，肉桂醛100%殺滅滋養(yǎng)體和感染性幼蟲的劑量分別為50和8 mg/L，半數(shù)有效濃度分別為105.3 μmol/mL和13.64 μmol/mL;使用劑量在50 mg/L時(shí)可完全抑制小瓜蟲包囊孵化[30]。因此在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中，肉桂醛的使用量一般為10～1 000 mg/kg，本研究中的菌株對(duì)肉桂醛的抗性較強(qiáng)，推測(cè)將其添加于含肉桂醛的飼料中，可保持較好的活性，從而進(jìn)入消化道發(fā)揮益生作用。

2.4 高產(chǎn)酶活且耐受肉桂醛芽孢桿菌的鑒定

通過測(cè)定各菌株的16S rDNA序列，并在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，鑒定菌株2-D、5-D、6-D、7-D、8-D為枯草芽孢桿菌，菌株1-D、3-D、9-D 為地衣芽孢桿菌，菌株4-D為解淀粉芽孢桿菌。

3 結(jié)論

肉桂醛是從中草藥肉桂中提取的一種脂溶性活性物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗菌作用，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的理想替代品之一，不過肉桂醛可能會(huì)影響腸道內(nèi)的益生菌數(shù)量。本研究篩選的芽孢桿菌對(duì)肉桂醛有一定的耐受力，同時(shí)具有較強(qiáng)的產(chǎn)胞外蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶的活性，有作為益生菌應(yīng)用于含肉桂醛飼料中，與肉桂醛互補(bǔ)，共同提高水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能和抗病性的潛力。

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