伴不同gH基因型人巨細(xì)胞病毒感染的免疫性血小板減少癥患兒臨床特征研究

張小同 陳露燕

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是一種獲得性免疫介導(dǎo)的疾病，其特征為由于血小板破壞過(guò)多或產(chǎn)血小板減少引起的外周血血小板減少，以廣泛的皮膚黏膜出血為主要臨床表現(xiàn)。ITP是兒童常見的出血性疾病，發(fā)病率約為（4～5）/10萬(wàn)，5歲以下兒童多見，約7/10萬(wàn)，兒童男性發(fā)病率較女性高。大部分患兒于發(fā)病后1～6個(gè)月內(nèi)痊愈，10%～20%患兒呈慢性病程。病死率為0.5%～1.0%，主要致死原因?yàn)轱B內(nèi)出血。約2/3 ITP患兒有前驅(qū)感染史，其中人巨細(xì)胞病毒（hu－man cytomegalovirus，HCMV）感染率較高，陽(yáng)性率約20%～50%[1-2]。

HCMV的基因?yàn)榫€性雙股DNA分子，長(zhǎng)約240 kb，由長(zhǎng)單一序列（long unique sequence，UL）和短單一序列（short unique sequence，US） 組成。包膜糖蛋白 H（glycoprotein H,gH）是HCMV進(jìn)入宿主細(xì)胞所需的兩種糖蛋白復(fù)合物（gH/gL/gO和gH/gL/UL128/UL130/UL131A）的主要組成成分。已有研究顯示，HCMV gH基因多態(tài)性與疾病分布、臨床表現(xiàn)存在相關(guān)[3-4]。本研究針對(duì)伴HCMV感染的ITP患兒，研究gH基因多態(tài)性與其臨床表現(xiàn)、預(yù)后的關(guān)系，為臨床診治及科學(xué)研究提供參考。

1 對(duì)象和方法

1.2 Taqman探針熒光定量PCR檢測(cè)gH基因型

1.2.1 儀器和試劑 采用ABI7500熒光定量PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。在gH基因兩端的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，正向引物序列：TGTTTTCACGCAGGAAGCGG，反向引物序列：TGGATCACGCCGCTGAACC。在gH基因的分型位置設(shè)計(jì)兩種探針，一種探針識(shí)別gHl分型，另一種探針識(shí)別gH2分型。gHl型探針5′端用FAM標(biāo)記，3′端用 BHQl標(biāo)記，序列：FAM-CATCCGAAGCGCTGGACCCTCACG-BHQ1；gH2 型探針 5′端用 HEx 標(biāo)記，3′端用 BHQl標(biāo)記，序列：HEX-TATCCGAACCGCTGGACAAAGCG-BHQ1。引物、探針均由寶生物公司（日本大津市）合成。

1.2.2 方法 采用RTFQ PCR法同時(shí)進(jìn)行HCMV定量及gH分型。利用熒光雜交探針在一次PCR反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)和鑒別HCMV gH1和HCMV gH2基因型。該方法能夠快速、穩(wěn)定、明確區(qū)分兩種HCMV gH基因型[9]。

1.3 治療 ITP治療方案參考2013年《兒童原發(fā)性免疫性血小板減少癥診療建議》[12]：（1）PLT＜20×109/L，伴活動(dòng)性出血或有治療要求予抗ITP治療；（2）PLT（20～100）×109/L，無(wú)活動(dòng)性出血，1～3d 監(jiān)測(cè)血常規(guī)；（3）PLT恢復(fù)至100×109/L后每1～2周監(jiān)測(cè)血常規(guī)，至少隨訪3個(gè)月?？共《局委熤刚骱头桨竻⒖?012年中華醫(yī)學(xué)會(huì)《兒童巨細(xì)胞病毒性疾病診斷和防治的建議》[8]。

1.4 預(yù)后評(píng)估[5]完全恢復(fù)：3個(gè)月內(nèi)PLT恢復(fù)至100×109/L（相隔7d以上測(cè)定2次）。持續(xù)性 ITP：PLT＜100×109/L持續(xù)超過(guò)3個(gè)月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布計(jì)量資料用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料用中位數(shù)及范圍表示，組間比較用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 研究期間共新診斷136例ITP患兒，66例HCMV DNA陽(yáng)性，陽(yáng)性率48.5%，因19例失訪，故41例新診斷ITP納入本研究。其中g(shù)H1組26例（63.4%），gH2組型15例（36.6%）；男27例，女14例，男女比例1.9:1，兩組男性比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（15/26比12/15，χ2=2.105，P=0.147）；月齡中位數(shù) 4.0（0，15）個(gè)月，gH1組月齡 3.5（0，15）個(gè)月，和 gH2 組[月齡 4.0（0,15）個(gè)月]比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.736，P=0.462），其中＜1歲嬰兒37例，占90.2%。

2.2 不同發(fā)病時(shí)間ITP患兒的HCMV gH基因型分布情況 將41例新診斷ITP患兒按不同HCMV發(fā)病時(shí)間將患兒分為3組，＜3周為先天性感染組，＜3月齡為圍生期感染組，≥3月齡為生后感染組。3組患兒的gH基因型分布情況見表1。

“嗯，你別慌、別急！”李曉英從一旁戰(zhàn)士們的哄笑聲中，明白恭建兵是故意在捉弄自己、戲耍自己，從容應(yīng)答著。冷不丁，一針管對(duì)準(zhǔn)恭建兵的屁股蛋子扎了過(guò)去。

表1 不同發(fā)病時(shí)間ITP患兒的HCMV gH基因型分布情況（例）

由表1可見，HCMV gH基因型在不同感染年齡組中分布均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），均以gH1型多見。

先天性HCMV感染6例，占新診斷ITP患兒的14.6%，其中5例先天性HCMV感染患兒（4例gH1型和1例gH2型）伴神經(jīng)系統(tǒng)影像學(xué)異常，表現(xiàn)為腦室擴(kuò)張、室管膜下出血、室管膜下囊腫、腦白質(zhì)信號(hào)異常、皮層發(fā)育不良等。

2.3 41例不同HCMV gH基因型 ITP患兒臨床表現(xiàn)、治療及預(yù)后比較 見表2。

表2 41例不同HCMV gH基因型ITP患兒臨床表現(xiàn)、治療及預(yù)后比較（例）

由表2可見，兩組患兒臨床表現(xiàn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。兩組治療措施差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。gH2組3個(gè)月內(nèi)PLT完全恢復(fù)率較gH1組低（P=0.018）；兩組PLT完全恢復(fù)時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.804）。

2.4 41例不同HCMV gH基因型ITP患兒實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 見表3。

由表3可見，本研究全部病例均行HCMV IgM測(cè)定，陽(yáng)性率31.7%。4例行pp65測(cè)定，陽(yáng)性比例2/4。34例行血小板抗體檢查均陽(yáng)性，其中8例血小板抗體≥80%。21例有骨髓涂片報(bào)告，包括gH1型13例，gH2型8例，其中13例有巨核細(xì)胞增生，13例產(chǎn)板功能異常。gH2型高血小板抗體比例稍高于gH1型，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.228），gH2型骨髓檢查巨核細(xì)胞增生比例稍高于gH1型，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.400），兩組各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查及骨髓檢查均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3 41例不同HCMV gH基因型ITP患兒實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較（例）

3 討論

ITP是一種兒童常見的血液系統(tǒng)疾病，以血小板減少、皮膚黏膜出血為主要表現(xiàn)。原發(fā)性ITP定義為單純的免疫系相關(guān)的血小板減少，沒(méi)有任何明顯發(fā)病原因或潛在因素。繼發(fā)性ITP指除原發(fā)性免疫性血小板減少癥外所有其他免疫性血小板減少癥。兒童ITP的臨床出血癥狀與血小板減少的程度不一致，部分患者僅有血小板減少，沒(méi)有出血癥狀，故2009年ITP國(guó)際工作組將“特發(fā)性血小板減少性紫癜”更名為“免疫性血小板減少癥”。ITP按病程長(zhǎng)短分三型：（1）新診斷ITP（newly diagnosed ITP）：病程＜3 個(gè)月；（2）持續(xù)性 ITP（persistent ITP）：病程 3～12 個(gè)月；（3）慢性 ITP（chronic ITP）：病程＞12 個(gè)月。本研究以新診斷ITP患兒為研究對(duì)象。ITP迄今發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，可能與病毒感染、預(yù)防接種、免疫系統(tǒng)疾病、免疫缺陷、結(jié)核等相關(guān)。目前所知與ITP相關(guān)的病原體有十余種，如HCMV、EB病毒、皰疹病毒、麻疹病毒、水痘病毒、肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、幽門螺桿菌等,其中HCMV感染率較高。

臨床已開展的檢測(cè)HCMV活動(dòng)性感染指標(biāo)以血清IgM、pp65陽(yáng)性為主，但是HCMV感染約2周后IgM抗體才能達(dá)到能檢測(cè)到的水平.此時(shí)病原體有可能已被機(jī)體免疫反應(yīng)抑制而處于潛伏感染狀態(tài)。嬰幼兒免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完善，不能產(chǎn)生足夠的特異性IgM抗體，靈敏度低,易造成假陰性結(jié)果[7]。祝興元等[10]研究顯示，血pp65檢測(cè)的特異度達(dá)100%，但靈敏度只有59.2%。鄭曉群等[7]研究指出，HCMV感染嬰兒與新生兒、幼兒相比，尿液上皮細(xì)胞DNA檢測(cè)靈敏度更高。當(dāng)嬰兒尿液上皮細(xì)胞DNA拷貝對(duì)數(shù)值為4.55（即拷貝數(shù)3.5×104）時(shí),尿液上皮細(xì)胞中HCMV DNA載量對(duì)活動(dòng)性感染診斷的靈敏度和特異度分別為71.4%和75.2%。因此，本研究中嬰兒HCMV活動(dòng)性感染診斷取尿上皮細(xì)胞DNA載量對(duì)數(shù)≥4.55或血IgM、pp65至少一項(xiàng)陽(yáng)性。

HCMV包膜糖蛋白基因存在多態(tài)性，目前國(guó)內(nèi)外研究較多的如gB、gO、gN等糖蛋白基因和兒童HCMV感染臨床特點(diǎn)的相關(guān)[11-13]。gH基因多態(tài)性與臨床疾病的關(guān)系研究相對(duì)較少，Paradowska等[4]研究發(fā)現(xiàn)，先天性感染HCMV gH1基因型增加了感覺(jué)神經(jīng)性耳聾風(fēng)險(xiǎn)；研究顯示，嬰兒肺炎、肝炎綜合征、無(wú)黃疸型肝炎等疾病中以gH1型感染為主，而ITP患兒以gH2型感染為主[3]。故本研究針對(duì)ITP患兒伴HCMV感染的gH基因分型做進(jìn)一步討論。

本研究ITP伴HCMV感染患兒中年齡＜1歲嬰兒占90.2%，男性所占比例是女性的1.9倍。gH1和gH2兩種基因型以gH1型多見，占63.4%，HCMV感染發(fā)病年齡、性別分布無(wú)差異?？梢?，兒童HCMV感染相關(guān)ITP病例以小嬰兒、男性為主。

HCMV感染按發(fā)病時(shí)間可分為先天性（＜3周）、圍生期（3周～3個(gè)月）、生后感染（≥3個(gè)月）。先天性HCMV感染是導(dǎo)致新生兒畸形的主要病因之一，臨床表現(xiàn)為血小板減少、宮內(nèi)發(fā)育延遲、嬰兒肝炎綜合征、小頭畸形、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常影像學(xué)表現(xiàn)（包括腦室增大、顱內(nèi)鈣化、腦室周圍異?；芈?、皮層或小腦發(fā)育畸形），視網(wǎng)膜炎、感音性神經(jīng)性耳聾等。本研究各組gH基因型分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

近年來(lái)，在研究HCMV進(jìn)入宿主細(xì)胞的機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，HCMV在感染成纖維細(xì)胞（FB）和上皮細(xì)胞（EC）時(shí)是通過(guò)不同的進(jìn)入途徑發(fā)生的，這取決于不同的糖蛋白復(fù)合物抗原表位。HCMV進(jìn)入FB時(shí)，需要gB和gH/gL/gO組成的糖蛋白復(fù)合物相互作用。HCMV進(jìn)入EC過(guò)程中，除了依賴于 gB、gH/gL/gO，還需要由 gH、gL、UL128、UL130和UL131A組成的包膜五聚體復(fù)合物（PC）[14]，不同的包膜糖蛋白復(fù)合物分布差異，一定程度上決定了HCMV細(xì)胞嗜性不同，感染不同的組織細(xì)胞，導(dǎo)致臨床表現(xiàn)及預(yù)后上的差異。gH是組成包膜糖蛋白復(fù)合物gH/gL/gO三聚體、PC的主要構(gòu)成成分，其基因型的多態(tài)性是否可能導(dǎo)致包膜糖蛋白復(fù)合物分布不同，影響細(xì)胞嗜性尚不明確。本組研究中，ITP患兒出現(xiàn)的皮膚出血、發(fā)熱、科室、腹瀉、黃疸、肝腫大等臨床癥狀的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，gH基因型差異能否導(dǎo)致HCMV對(duì)不同組織細(xì)胞嗜性不同尚需擴(kuò)大樣本繼續(xù)研究。

HCMV感染相關(guān)ITP的致病機(jī)制尚不明確，目前公認(rèn)的是血小板自身抗體的產(chǎn)生，破壞血小板、損害骨髓巨核細(xì)胞或減少血小板的產(chǎn)生。也有些研究指出HCMV直接感染巨核細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞病變、血小板生成減少[15]。說(shuō)明部分常規(guī)免疫療法無(wú)效的ITP可能存在不同的致病機(jī)制共同作用。目前對(duì)HCMV感染伴ITP患兒是否行抗病毒治療尚有爭(zhēng)議，區(qū)別在于以免疫介導(dǎo)效應(yīng)為主，還是細(xì)胞病變效應(yīng)為主，在治療方案的選擇上可能具有重要的治療意義。從理論上講，免疫介導(dǎo)效應(yīng)對(duì)類固醇、免疫球蛋白治療有反應(yīng)，細(xì)胞病變效應(yīng)對(duì)更昔洛韋治療有反應(yīng)。然而，在臨床工作中很難區(qū)分這些效應(yīng)。本研究中g(shù)H2型感染患兒3個(gè)月內(nèi)血小板恢復(fù)率較gH1型低。另外，gH2型呈現(xiàn)高血小板抗體水平的病例較gH1型較高，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ITP患兒伴gH2型HCMV感染易出現(xiàn)持續(xù)的血小板降低，可能與產(chǎn)生高滴度的血小板抗體有關(guān)。gH1型巨核細(xì)胞產(chǎn)板功能異常比例較gH2型高，雖統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)差異，可能提示ITP患兒伴gH1型HCMV感染傾向于影響骨髓巨核細(xì)胞功能，破壞產(chǎn)板功能。由于本研究樣本量小，隨訪期短，gH分型對(duì)HCMV感染相關(guān)ITP臨床表現(xiàn)相關(guān)性和預(yù)后的確切價(jià)值有待日后進(jìn)行擴(kuò)大樣本量、延長(zhǎng)隨訪期的研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，ITP患兒伴HCMV感染的糖蛋白基因型以gH1型多見。ITP伴gH2型HCMV感染發(fā)展為持續(xù)性ITP可能性較大。