GOLPH3通過WNT信號(hào)通路調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及其機(jī)制的研究△

張猛，沙林，馬慶防，安剛，于如同，黎軍#

1徐州市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 徐州221000

2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 徐州221000

惡性膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，其惡性程度高、進(jìn)展快、預(yù)后差，即使采用手術(shù)、放療和化療等綜合治療手段，療效仍不理想，主要是由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞無限增殖所致。因此，探索膠質(zhì)瘤細(xì)胞無限增殖的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)潛在的分子治療靶點(diǎn)，開展腫瘤分子靶向治療是當(dāng)今腫瘤研究領(lǐng)域的趨勢(shì)與熱點(diǎn)。遺傳技術(shù)和生物學(xué)技術(shù)分析表明，高爾基體磷蛋白3（golgi phosphoprotein 3，GOLPH3）是一個(gè)全新的癌基因，能促進(jìn)人類腫瘤細(xì)胞的增殖[1]。在對(duì)GOLPH3調(diào)節(jié)高爾基體的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)功能的研究中發(fā)現(xiàn)，VPS35能夠與GOLPH3相互作用調(diào)控囊泡運(yùn)輸。通過這些發(fā)現(xiàn)可以推斷GOLPH3、VPS35可能是蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)中的關(guān)鍵分子，并且影響WNT信號(hào)通路下游信號(hào)發(fā)揮一系列的作用。WNT/β-catenin經(jīng)典信號(hào)通路的激活參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展，有可能成為治療膠質(zhì)瘤的新靶點(diǎn)。因此，本研究擬采用膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系為研究對(duì)象，應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）、EdU等方法，檢測GOLPH3對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，闡明GOLPH3通過調(diào)節(jié)WNT/β-catenin信號(hào)通路影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的分子靶向治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與材料

U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。siRNA oligo由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成，兔抗β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體購自美國Millipore Chemicon公司，兔抗GOLPH3單克隆抗體、兔抗WNT2單克隆抗體、兔抗G1/S-特異性細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）單克隆抗體、山羊抗VPS35單克隆抗體、兔抗β-catenin單克隆抗體均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。其他常規(guī)試劑為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、相對(duì)濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長。待細(xì)胞長滿瓶底后，棄掉培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶消化，2～3天后分瓶傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

將轉(zhuǎn)染negative control siRNA oligo和各siRNA oligo的細(xì)胞分別設(shè)為陰性對(duì)照組（siNC組）和下調(diào)組（siGOLPH3組、siWNT2組、siβ-catenin組）。將GOLPH3、WNT2、β-catenin基因序列交于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成目的小干擾序列及陰性對(duì)照小干擾序列。negative control siRNA oligo正義：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'，negative control siRNA oligo反義5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'；GOLPH3-siRNA oligo正義：5'-GUUAAGAAAUGUACGGGAATT-3'，GOLPH3-siRNA oligo反義：5'-UUACAGAUUACCUUUCUUGTT-3'；WNT2-siRNA oligo正義：5'-GACGAUGGGAAGCGCCAAGTT-3'，WNT2-siRNA oligo反義：5'-CUUGGCGCUU-CCCAUCUUCTT-3'；β-catenin siRNA oligo正義：5'-CAUGCAGAAUACAAAUGAUTT-3'，β-catenin siRNA oligo反 義 ：5'-GUACGUCUUAUGUUUACUATT-3'。 將脂質(zhì)體與siRNA按1∶2混合，每孔用量為脂質(zhì)體5μl，siRNA 10μl，各用 opti-MEM 培養(yǎng)基 250μl稀釋，室溫靜置5 min，將兩者混勻室溫靜置孵育20 min，然后直接將混合物加入6孔板中。輕輕搖晃混勻，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 h后換為含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞。

1.4 EdU實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖率

EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復(fù)制的DNA中，通過基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應(yīng)快速檢測細(xì)胞DNA復(fù)制活性，染色后熒光顯微鏡下增殖期細(xì)胞核呈紅色。Hoechst33342染色液是一種適用于活細(xì)胞細(xì)胞核染色的溶液，染色后熒光顯微鏡下細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，本研究通過檢測熒光強(qiáng)度而統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的增殖情況。

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染方法同上，共設(shè) siNC組、siGOLPH3組、siWNT2組、siβcatenin組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，采用EdU實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染效果及細(xì)胞增殖率。

1.4.2 EdU標(biāo)注 將細(xì)胞培養(yǎng)基按1000∶1的比例稀釋EdU溶液，制備適量50 μmol/L EdU培養(yǎng)基；每孔加入100 μl 50 μmol/L EdU培養(yǎng)基孵育2 h，棄培養(yǎng)基；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗細(xì)胞2次，每次5 min。

1.4.3 細(xì)胞固定 每孔加50 μl細(xì)胞固定液（即含4%多聚甲醛的PBS），室溫孵育30 min，棄固定液；每孔加入50 μl 2 mg/ml的甘氨酸，脫色搖床孵育5 min，棄甘氨酸溶液；每孔加入100 μl PBS，脫色搖床清洗5 min，棄PBS；每孔加入100 μl滲透劑（含0.5%Triton X-100的PBS），脫色搖床孵育 10 min，PBS清洗5 min。

1.4.4 Apollo染色 每孔加入100 μl的1×Apollo染色反應(yīng)液，避光，室溫，脫色搖床孵育30 min后，棄反應(yīng)液；加入100 μl滲透劑（含0.5%Triton X-100的PBS）脫色搖床清洗3次，每次10 min，棄滲透劑；每孔加入100 μl甲醇清洗2次，每次5 min，PBS清洗5 min。

1.4.5 DNA染色 用去離子水按100∶1的比例稀釋Hoechst33342反應(yīng)液，制備適量1×Hoechst33342反應(yīng)液，避光保存；每孔加入100 μl 1×Hoechst33342反應(yīng)液，避光，室溫，脫色搖床孵育30 min后，棄染色反應(yīng)液；每孔加入100 μl PBS清洗3次，每次10 min。

1.4.6 獲取圖像 熒光顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)100倍視野，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)（Hoechst）及增殖的細(xì)胞總數(shù)（EdU），計(jì)算增殖率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.5 Westernblot法檢測蛋白表達(dá)情況

1.5.1 提取細(xì)胞總蛋白U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA48 h后，吸出培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗3遍，每孔加入200μl含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，后將細(xì)胞碎片和裂解液移到1.5 ml的離心管中，4℃、12 000 r/min離心25 min，取上清轉(zhuǎn)移至無菌EP管中，檢測蛋白濃度后分裝到EP管中-80℃保存，取80μg蛋白樣品加入蛋白上樣液后煮沸5 min，上樣。

1.5.2 制膠、電泳和轉(zhuǎn)膜 配制10%分離膠和6%濃縮膠，80μg蛋白樣品上樣，100 mV、100 min電泳，電泳結(jié)束后，將聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）后的凝膠浸泡到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)液中平衡5 min。聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜在甲醇中浸泡3 min，活化后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)液中平衡5 min，再置于電泳膠上，用剪刀修剪膜邊緣，使其略大于膠的邊緣，玻璃棒趕除氣泡。將膜與膠夾在上下兩層濾紙中間，壓緊固定后置于電轉(zhuǎn)槽中，以100 mV恒壓轉(zhuǎn)膜100 min。根據(jù)Marker轉(zhuǎn)膜情況判斷轉(zhuǎn)膜效果。

1.5.3 封閉和抗體孵育 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用3%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，吸水紙吸干后，放入相應(yīng)一抗 GOLPH3（1∶1000）、β-actin（1∶1000）、WNT2（1∶200）、β-catenin（1∶1000）稀釋液中，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，吸水紙吸干后，加入對(duì)應(yīng)二抗（1∶3000），室溫、搖床孵育2 h。

1.5.4 蛋白檢測 于暗室中，將電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑（0.125 ml/cm2）混勻后均勻滴于PVDF膜上，去除多余液體，然后移入X線膠片盒中，曝光30 s～5 min后進(jìn)行顯影，定影。Western blot和熒光信號(hào)強(qiáng)度經(jīng)Image J軟件采集并處理分析。蛋白相對(duì)表達(dá)量為每種研究蛋白與內(nèi)參蛋白（actin）的比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GOLPH 3 siRNA的轉(zhuǎn)染效果及對(duì)WNT 2蛋白表達(dá)和U251細(xì)胞增殖的影響

相對(duì)于siNC組，siGOLPH3組細(xì)胞中GOLPH3蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.166±0.069）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.14，P=0.007），表明siRNA轉(zhuǎn)染效果佳。siGOLPH3組細(xì)胞中WNT2蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.480±0.052）低于siNC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.09，P=0.010）。與siNC組相比，siGOLPH3組細(xì)胞增殖率（0.177±0.033）%明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.70，P=0.007）。（圖1、圖2）

圖1 Western blot法檢測GOLPH 3及WNT 2蛋白表達(dá)情況

圖2 EdU實(shí)驗(yàn)檢測siNC組及siGOLPH 3組 U251細(xì)胞的增殖情況（×100）

2.2 WNT2siRNA的轉(zhuǎn)染效果及對(duì)β-catenin、GOLPH3蛋白表達(dá)和U251細(xì)胞增殖的影響

相對(duì)于siNC組，siWNT2組細(xì)胞中WNT2蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.336±0.056）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.79，P=0.007），表明siRNA轉(zhuǎn)染效果佳。siWNT2組細(xì)胞中β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.596±0.091）低于siNC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.43，P=0.047），表明WNT2對(duì)β-catenin產(chǎn)生影響。siWNT2組細(xì)胞中GOLPH3蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.010±0.052），與siNC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明WNT2對(duì)GOLPH3蛋白表達(dá)無影響。與siNC組相比，siWNT2組細(xì)胞增殖率（0.676±0.029）%明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.04，P=0.008）。（圖3、圖4）

圖3 Western blot法檢測GOLPH 3、WNT 2及其下游 β-catenin蛋白表達(dá)情況

圖4 EdU實(shí)驗(yàn)檢測siNC組及siWNT 2組 U251細(xì)胞的增殖情況（×100）

2.3 β-cateninsiRNA的轉(zhuǎn)染效果及對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響

相對(duì)于siNC組，siβ-catenin組細(xì)胞中β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.365±0.034）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.60，P=0.003），表明siRNA轉(zhuǎn)染效果佳。與siNC組相比，siβ-catenin組細(xì)胞增殖率（0.557±0.167）%降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.90，P=0.020）。（圖5、圖6）

圖5 Western blot法檢測 β-catenin蛋白表達(dá)情況

圖6 EdU實(shí)驗(yàn)檢測siNC組及 si β-catenin組 U251細(xì)胞的增殖情況（×100）

3 討論

由于傳統(tǒng)的手術(shù)切除、化療和放療對(duì)膠質(zhì)瘤的治療效果不佳，故膠質(zhì)瘤的基因治療是目前的研究熱點(diǎn)之一。GOLPH3是一個(gè)高度保守的34 kD大小的蛋白[1-2]，主要富集于高爾基體囊泡反面的膜外圍，也存在于胞漿池[3]、小管、囊泡、內(nèi)涵體小室以及質(zhì)膜中[4-5]。研究表明，GOLPH3的這種分布對(duì)維持高爾基體的形態(tài)以及囊泡的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)都起著重要作用[6]。Scott等[1]報(bào)道，GOLPH3在肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等多種人類實(shí)體瘤中高表達(dá)，而且GOLPH3可以通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）-蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）-雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycinm，MTOR）信號(hào)通路影響腫瘤的增殖及對(duì)雷帕霉素的敏感性。通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，下調(diào)GOLPH3的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，過表達(dá)GOLPH3則促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及對(duì)雷帕霉素的敏感性[1-2,7]。因此提出GOLPH3是一個(gè)全新的致癌基因，而且是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的高爾基體癌基因蛋白[1-2]。此后，相繼有研究報(bào)道GOLPH3在橫紋肌肉瘤及膠質(zhì)瘤中也有高表達(dá)[8-9]，進(jìn)一步證實(shí)了GOLPH3在人類實(shí)體瘤中的致癌活性。

遺傳技術(shù)和生物學(xué)技術(shù)分析表明，GOLPH3能促進(jìn)人類腫瘤細(xì)胞的增殖。腫瘤細(xì)胞都具有較強(qiáng)的增殖能力，在細(xì)胞周期中，處于分裂期的細(xì)胞增多，而將癌基因敲除后，細(xì)胞分裂減少，細(xì)胞增殖能力下降[10]。Zhou等[11]此前發(fā)現(xiàn)下調(diào)GOLPH3可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的凋亡以及抑制U251細(xì)胞的增殖。為進(jìn)一步研究GOLPH3對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及凋亡的作用，該研究選用膠質(zhì)瘤U87等細(xì)胞系作為研究對(duì)象，觀察GOLPH3對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和增殖的影響，明確了GOLPH3對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響具有普遍性。研究結(jié)果表明，過表達(dá)GOLPH3可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，下調(diào)GOLPH3可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡[11]。

進(jìn)一步研究表明，GOLPH3在高爾基體分泌泡形成和運(yùn)輸過程中起著重要的作用[12]。GOLPH3與高爾基體反面的基質(zhì)（trans Golgi network，TGN）動(dòng)態(tài)相連，快速從TGN移動(dòng)到細(xì)胞質(zhì)，并分布于細(xì)胞內(nèi)分泌泡和細(xì)胞質(zhì)膜[13]。作為TGN蛋白家族的一員，GOLPH3與高爾基體的蛋白質(zhì)加工、分類、包裝與轉(zhuǎn)運(yùn)功能密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的蛋白質(zhì)，以囊泡的形式進(jìn)入高爾基體的順面，并經(jīng)加工修飾后，在高爾基體的反面以出芽的方式排出分泌泡，到達(dá)質(zhì)膜后囊泡與質(zhì)膜融合并排出分泌蛋白。應(yīng)用基因敲除技術(shù)減少細(xì)胞內(nèi)GOLPH3的表達(dá)后，從高爾基體順面轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)膜的分泌蛋白或脂質(zhì)明顯減少，而同時(shí)這種遞質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成并進(jìn)入高爾基體順面的量并未改變，由此說明GOLPH3在高爾基體分泌泡形成和運(yùn)輸過程中起著重要的作用[14]。

在對(duì)GOLPH3調(diào)節(jié)高爾基體的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)功能的研究中發(fā)現(xiàn)，VPS35能夠與GOLPH3相互作用調(diào)控囊泡運(yùn)輸。VPS35是Retromer復(fù)合體的組成部分，Retromer復(fù)合體由2個(gè)亞基組成，負(fù)責(zé)裝載的亞基由VPS26、VPS29、VPS35組成，調(diào)控細(xì)胞跨膜蛋白從核內(nèi)體到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)[15-18]。應(yīng)用基因敲除技術(shù)敲除VPS35，發(fā)現(xiàn)會(huì)抑制一些跨膜蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，例如表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、WNT配體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等，并且影響WNT等一些表面受體的功能[19-22]。

WNT是一類分泌型糖蛋白，通過自分泌或旁分泌發(fā)揮作用[23]。WNT信號(hào)通路能引起細(xì)胞內(nèi)β-catenin積累。β-catenin是一種多功能蛋白質(zhì)，在細(xì)胞連接處與鈣黏素相互作用，參與形成黏合帶，而游離的β-catenin可進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖等[24-25]。WNT/β-catenin信號(hào)通路的激活參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展，其異常表達(dá)、激活及支架蛋白AXIN、腺瘤性結(jié)腸息肉病基因或β-catenin的突變都會(huì)導(dǎo)致腫瘤的形成[26-29]。WNT信號(hào)通路可概括為：WNT→卷曲蛋白→蓬亂蛋白→β-catenin降解復(fù)合體解散→β-catenin積累進(jìn)入細(xì)胞核→結(jié)合T細(xì)胞因子→激活基因轉(zhuǎn)錄（如c-myc、cyclin D1）[30]。 通 過 這 些 發(fā) 現(xiàn) 可 以 推 斷GOLPH3、VPS35可能是蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)中的關(guān)鍵分子，通過影響從核內(nèi)體到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)WNT及其下游信號(hào)發(fā)揮一系列的作用。

本研究在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中，用siRNA下調(diào)GOLPH3表達(dá)后，應(yīng)用Western blot法檢測WNT2的表達(dá)。結(jié)果顯示，下調(diào)GOLPH3表達(dá)后，WNT2的表達(dá)受到抑制。應(yīng)用EdU法檢測發(fā)現(xiàn)分別下調(diào)WNT2、β-catenin后，U251細(xì)胞增殖受到抑制，提示GOLPH3對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響有可能通過WNT/β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。

文獻(xiàn)表明，VPS35能夠與GOLPH3相互作用調(diào)控囊泡運(yùn)輸[16]。本研究結(jié)果推測，GOLPH3通過WNT/β-catenin信號(hào)通路參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展，可能是通過VPS35介導(dǎo)，調(diào)節(jié)WNT在核內(nèi)體和高爾基體之間的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)而發(fā)揮作用。為此，下一步將以此為研究內(nèi)容進(jìn)一步深化研究。

本研究期望通過對(duì)GOLPH3及其信號(hào)通路進(jìn)行更加深入的研究，進(jìn)一步揭示GOLPH3調(diào)控膠質(zhì)瘤生長的機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供理論依據(jù)。此外，也為膠質(zhì)瘤之外的其他腫瘤的分子靶向治療提供重要的參考與理論支持。