牙本質(zhì)生物活性材料的相關(guān)性能及對(duì)牙髓干細(xì)胞周期及形態(tài)的影響

王 方,席 爽,逯 宜

(1西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院,陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安 710004;2西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科;*通訊作者,E-mail:xjtuff@126.com)

齲壞、牙周炎、創(chuàng)傷等原因?qū)е碌难懒腥睋p或缺失會(huì)損害患者咀嚼功能及美觀,并降低患者生活質(zhì)量[1,2]。同其他組織工程一樣,支架材料在牙本質(zhì)再生過(guò)程中提供新組織生成的物理及生化支持[3,4]。組織工程材料對(duì)牙再生的意義非凡[5]。現(xiàn)有人造成牙相關(guān)支架材料缺乏成牙誘導(dǎo)因素,包括各種化學(xué)因子及材料表面微結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo),導(dǎo)致很難再生出滿足臨床需求的牙本質(zhì)組織。

牙本質(zhì)中的生物活性物質(zhì)是經(jīng)成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌并儲(chǔ)存在牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)中,成牙本質(zhì)細(xì)胞外的理化微環(huán)境對(duì)誘導(dǎo)牙源性細(xì)胞的牙再生能力具有重要意義。生物體自身的細(xì)胞外基質(zhì)及所處的微環(huán)境對(duì)生物體的細(xì)胞行為具有重要的誘導(dǎo)作用。在牙組織工程中,牙本質(zhì)基質(zhì)富含成牙相關(guān)生物活性因子和適宜牙源性細(xì)胞生長(zhǎng)的微結(jié)構(gòu),可以為多種牙源性細(xì)胞提供良好的成牙誘導(dǎo)微環(huán)境,促進(jìn)牙源性細(xì)胞發(fā)揮功能[6]。大量的新鮮離體牙可為制備牙本質(zhì)基質(zhì)提供豐富的來(lái)源[7]。

如何有效保存和利用牙本質(zhì)基質(zhì)的生物活性物質(zhì)和結(jié)構(gòu)為牙組織工程提供理想的支架材料是牙組織工程的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。有研究顯示，乙二胺四乙酸(EDTA)表面脫礦處理能夠使膠原纖維暴露并且可以改善牙本質(zhì)的滲透性，增加牙本質(zhì)生物活性物質(zhì)的釋放。經(jīng)EDTA處理的牙體組織可釋放成牙活性物質(zhì)，營(yíng)造良好的誘導(dǎo)微環(huán)境[8-10]。經(jīng)過(guò)冷凍干燥處理的材料在密封處理后能在20 ℃左右或4 ℃長(zhǎng)期儲(chǔ)存。經(jīng)冷凍干燥處理，材料可以維持凍干處理前的形態(tài)、構(gòu)造及性質(zhì)，方便儲(chǔ)藏運(yùn)輸，具有廣闊的前景。為了提高生物產(chǎn)品的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，冷凍干燥同種異體牙本質(zhì)粉作為骨再生材料已成功應(yīng)用于牙周骨缺損患者的臨床治療[11]。

本研究探討了凍干牙本質(zhì)支架材料(FD)相關(guān)性能及其對(duì)牙髓干細(xì)胞(DPSCs)細(xì)胞活性及形態(tài)的影響,初步為牙本質(zhì)基質(zhì)支架材料的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人未經(jīng)處理的新鮮拔除牙(西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院);羥基磷灰石-磷酸三鈣支架材料(HA,四川大學(xué));胎牛血清;α-MEM培養(yǎng)液(Gibco,美國(guó));谷氨酰胺(Gibco,美國(guó));羅丹明-鬼筆環(huán)肽(Sigma,USA);DAPI(Sigma,美國(guó));蘇木精-伊紅(Sigma,USA);Collagen type I ELISA kit(上海巧伊,中國(guó));propidium iodide(PI)(Sigma,USA)。真空冷凍干燥機(jī)(Osterode/Harz,德國(guó));酶標(biāo)儀(BioTek,USA);激光共聚焦顯微鏡(Olympus,日本);Matlab軟件(MathWorks,USA);EZTest/CE萬(wàn)能材料實(shí)驗(yàn)機(jī)(SHIMADZU,Japan)。

1.2 FD的制備

將人未經(jīng)處理的新鮮拔除牙牙齒在-80 ℃中保存3個(gè)月以上，刮除牙周組織及牙髓組織后，將牙體組織置入超聲清洗機(jī)中超聲震蕩清洗5 min，將清潔后的牙體組織表面采用EDTA梯度脫礦處理，-80 ℃預(yù)凍2 h，將預(yù)凍完成的牙體組織置于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)，真空度0.06 mbar，冷井溫度-54 ℃，置物倉(cāng)-30 ℃的條件下，冷凍干燥72 h。輻照滅菌后可長(zhǎng)期儲(chǔ)存，用于后續(xù)力學(xué)及細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖1)。

A.新鮮拔除牙;B.冷凍干燥處理后牙體組織圖1 新鮮拔除牙冷凍干燥處理前后對(duì)比圖Figure 1 Tooth before and after low temperature storage and freeze drying treatment

1.3 撓曲強(qiáng)度檢測(cè)

人牙本質(zhì)組織體積較小,測(cè)量材料撓曲強(qiáng)度的通用配件無(wú)法用于測(cè)定小體積的人牙本質(zhì)樣本。為此,本研究特制了檢測(cè)人牙本質(zhì)的三點(diǎn)彎曲配件,用來(lái)檢測(cè)牙本質(zhì)的撓曲強(qiáng)度。該配件由上部配件及下部配件相對(duì)組成,上部配件為單個(gè)金屬壓頭,下部配件為兩個(gè)間隔5.5 mm的金屬壓頭組成,上部壓頭位于兩個(gè)下部壓頭的中央。下部壓頭的上端為弧形,在測(cè)量過(guò)程中可起到集中壓力的作用(見(jiàn)圖2)。測(cè)量前,將牙本質(zhì)小柱垂直搭在兩個(gè)下部配件壓頭上,放置時(shí),盡量使兩個(gè)壓頭外側(cè)的牙本質(zhì)小柱長(zhǎng)度相等。測(cè)量時(shí),上部配件以1 mm/min的速度緩緩下降,直至接觸牙本質(zhì)小柱,將撓度強(qiáng)度測(cè)試數(shù)據(jù)輸入Matlab軟件,并制作凍干牙本質(zhì)(FD)、未處理牙本質(zhì)(D)及羥基磷灰石-磷酸三鈣(HA)三組的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。

1.4 材料結(jié)構(gòu)的組織學(xué)檢測(cè)

對(duì)采用1.2方法制備的凍干牙本質(zhì)生物活性材料(FD)和未凍干處理牙本質(zhì)(D)兩組材料進(jìn)行組織學(xué)染色處理,對(duì)獲得的組織學(xué)切片篩選各組材料不同角度的牙本質(zhì)小管剖面的差異進(jìn)一步觀察。

圖2 撓曲強(qiáng)度檢測(cè)示意及定制配件(左下圖)Figure 2 Flexural strength test and costumized fittings shown below left

1.5 膠原釋放能力檢測(cè)

采用ELISA法測(cè)定FD、未處理牙本質(zhì)(D)、HA中Ⅰ型膠原(COL-1)的釋放能力。將FD與未處理牙本質(zhì)(D)置入液氮,經(jīng)液氮冷卻,材料的脆性增加,將研磨后獲得的粉樣材料等量分裝,將HA粉末狀按相同質(zhì)量分裝,三組粉末滅菌儲(chǔ)存。每組材料按粉液(α-MEM培養(yǎng)液)比2 g ∶10 ml的比例配制,不加材料粉末的α-MEM培養(yǎng)液為對(duì)照組。將加入α-MEM培養(yǎng)液的FD組、D組、HA組和α-MEM組置入孵箱,分別在1,2,3,4,5,6,7 d取經(jīng)過(guò)濾的上清液,按照ELISA檢測(cè)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。采用ELISA法測(cè)定兩個(gè)牙本質(zhì)組及HA組材料的吸光度(450 nm波長(zhǎng)),并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣本數(shù)值。

1.6 人牙髓干細(xì)胞(DPSCs)的獲取及培養(yǎng)

用滅菌高速牙科手機(jī)沿牙體長(zhǎng)軸的方向磨一道長(zhǎng)溝,將滅菌小鑿抵住長(zhǎng)溝,用力鑿開(kāi)牙體組織,拔髓針拔髓,采用組織塊法結(jié)合酶消化法將獲得的牙髓細(xì)胞及組織置于含15% FBS的α-MEM中培養(yǎng)。

1.7 材料表面DPSCs細(xì)胞骨架形態(tài)檢測(cè)

采用細(xì)胞骨架免疫熒光染色法檢測(cè)各組材料(FD、D、HA、玻片)對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞骨架形態(tài)的影響。DPSCs在四組材料表面培養(yǎng)17 h,進(jìn)行固定,漂洗,Triton X-100破膜,PBS漂洗,1%BSA封閉1 h,PBS漂洗,37 ℃下phalloidin-rhodamine避光孵化1 h,PBS漂洗,DAPI復(fù)染5 min,PBS漂洗,封片后觀察細(xì)胞骨架蛋白的特點(diǎn)。

1.8 不同材料對(duì)DPSCs細(xì)胞周期的影響

將DPSCs分別接種于FD、D、HA及玻片材料,分別置入含15% FBS的α-MEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)3 d后,胰蛋白酶分別消化各組材料表面的DPSCs,經(jīng)碘化丙啶染色,采用流式細(xì)胞儀分析材料表面DPSCs的細(xì)胞周期分布。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 撓曲強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)力-應(yīng)變曲線顯示，D組的斷裂應(yīng)力略大于FD組，遠(yuǎn)大于HA組；在同一應(yīng)變值下，D組加載應(yīng)力高于FD組。D組撓曲強(qiáng)度為(194.1±24.3)MPa,FD組撓曲強(qiáng)度為(166.1±57.5)MPa,HA組撓曲強(qiáng)度為(6.2±0.2)MPa。彈性模量D組為(5.8±2.1)GPa,FD組為(4.7±1.5)GPa,HA組為(0.05±0.01)GPa。從撓曲強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,FD組的撓曲強(qiáng)度及彈性模量較D組略低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而HA組顯著低于其他兩組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖3)。

FD:凍干牙本質(zhì);D:未處理牙本質(zhì);HA:羥基磷灰石-磷酸三鈣;與HA組比較,**P<0.01圖3 三組材料的力學(xué)性能檢測(cè)Figure 3 Mechanical properties testing of materials in three groups

2.2 處理前后不同剖面牙體組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果

不同角度方向的FD組與未處理牙本質(zhì)組(D組)材料的HE染色結(jié)果顯示,FD組與D組牙本質(zhì)小管結(jié)構(gòu)清晰,凍干處理未明顯改變牙本質(zhì)小管的組織結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖4)。

圖4 FD與D組牙本質(zhì)小管的HE染色結(jié)果Figure 4 HE staining results of FD and D

2.3 膠原釋放能力檢測(cè)結(jié)果

兩個(gè)牙本質(zhì)組液體能通過(guò)ELISA法檢測(cè)出COL1的存在,而HA組和α-MEM組均無(wú)Ⅰ型膠原檢出。COL1在各牙本質(zhì)組的含量除第5天兩組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其余時(shí)間冷凍干燥處理對(duì)牙本質(zhì)的膠原釋放能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖5)。

與D組比較，*P<0.05圖5 兩個(gè)牙本質(zhì)組的Ⅰ型膠原檢測(cè)吸光度值Figure 5 Type Ⅰ collagen detection values in two dentin groups

2.4 細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定FD、D、HA及玻片表面DPSCs的細(xì)胞周期分布特點(diǎn)為:S+G2/M相的細(xì)胞百分比最低組和最高組分別為HA組α-MEM組,兩個(gè)牙本質(zhì)組S+G2/M相的細(xì)胞百分比相似,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖6)。

2.5 各組材料表面DPSCs的肌動(dòng)蛋白熒光檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞肌動(dòng)蛋白熒光強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)可反應(yīng)細(xì)胞骨架的張力、范圍及細(xì)胞和支架材料的關(guān)系。兩個(gè)牙本質(zhì)組肌動(dòng)蛋白熒光粗大清晰、密集,且DPSCs間的肌動(dòng)蛋白熒光可見(jiàn)重疊區(qū)域;而HA組及玻片組的牙髓干細(xì)胞肌動(dòng)蛋白熒光不清晰,強(qiáng)度較弱,細(xì)胞間的交通也較欠缺(見(jiàn)圖7)。

3 討論

牙本質(zhì)具有合適的機(jī)械性能并含有豐富的成牙相關(guān)活性物質(zhì),是一種適合牙再生的組織工程生物支架材料。有明確證據(jù)顯示脫礦牙本質(zhì)材料可用于牙再生[12]。然而牙本質(zhì)生物材料保存方法的不足阻礙了這些研究成果的臨床轉(zhuǎn)化。冷凍干燥能夠延長(zhǎng)生物制品儲(chǔ)存的長(zhǎng)期穩(wěn)定性,保存材料原本的理化性能并具有降低免疫原性的作用,結(jié)合可接受的處理費(fèi)用使得冷凍干燥技術(shù)能夠用于牙本質(zhì)基質(zhì)生物材料的制備中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,本研究制備的FD具有與未處理牙本質(zhì)類似的理化性能,且對(duì)DPSCs的細(xì)胞活性及骨架蛋白結(jié)構(gòu)具有積極作用。

牙本質(zhì)的力學(xué)性能優(yōu)越,能夠在一定程度上抵御和降低牙合力對(duì)牙齒的沖擊。許多牙科充填材料及全瓷材料的研制均希望達(dá)到牙本質(zhì)相似的力學(xué)性能。許多細(xì)胞支架材料的開(kāi)發(fā)也著重于與牙本質(zhì)組織有相似的性能。

圖6 FD、D、HA及α-MEM組DPSCs各相細(xì)胞分布圖Figure 6 Cell distribution of DPSCs in FD, D, HA and α-MEM groups

圖7 凍干牙本質(zhì)活性生物材料(FD),未凍干牙本質(zhì)(D),羥基磷灰石/磷酸三鈣(HA),蓋玻片(coverslip)對(duì)牙髓干細(xì)胞肌動(dòng)蛋白免疫熒光強(qiáng)度及結(jié)構(gòu)的影響 (scale bar=100 μm)Figure 7 Effects of freeze-dried dentin bioactive materials(FD), dentin(D), hydroxyapatite/tricalcium phosphate(HA) and coverslip on the immunofluorescence intensity and structure of actin in dental pulp stem cells (scale bar=100 μm)

骨與牙本質(zhì)是人體內(nèi)的主要硬組織,二者在細(xì)胞組成、組織結(jié)構(gòu)、功能行使、組織來(lái)源上差異顯著。本研究中用于制備凍干牙本質(zhì)的流程在凍干骨制備流程上經(jīng)過(guò)改良,制備而成的凍干牙本質(zhì)具有良好的撓曲強(qiáng)度及彈性模量,這對(duì)細(xì)胞層面的組織再生及宏觀層面的牙齒功能行使均有積極的作用。

材料的力學(xué)性能、構(gòu)成、化學(xué)成分、與細(xì)胞接觸部分的結(jié)構(gòu)特征等等因素均會(huì)影響細(xì)胞與材料的初步接觸、黏附及在材料表面及內(nèi)部的生長(zhǎng)[13]。本研究中各組材料與DPSCs相互作用的體外研究顯示:FD組與D組表面DPSCs細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)更為清晰,骨架蛋白熒光強(qiáng)度高,細(xì)胞間交通明顯,表明牙本質(zhì)的表面形態(tài)及儲(chǔ)藏的多種成牙相關(guān)蛋白能夠促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)行為。細(xì)胞表面及內(nèi)部存在大量感受外部環(huán)境的相關(guān)結(jié)構(gòu),細(xì)胞能夠根據(jù)捕獲的信息對(duì)材料做出進(jìn)一步反應(yīng),即地形學(xué)(topographies)[14]。類似地,動(dòng)力傳導(dǎo)(mechanotransduction)理論認(rèn)為,生物體細(xì)胞所處環(huán)境中眾多因素,如材料結(jié)構(gòu)、細(xì)胞受力情況等可經(jīng)細(xì)胞內(nèi)在處理后轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)在的化學(xué)信息,這些化學(xué)信息將進(jìn)一步影響細(xì)胞的增殖、分化及黏附等相關(guān)功能[15]。DPSCs在不同支架材料表面的長(zhǎng)期生長(zhǎng)分化模式可能與細(xì)胞和不同材料最初的接觸模式有關(guān)。有研究顯示牙髓干細(xì)胞-材料第一階段的相互作用(包括細(xì)胞接觸、黏附、伸展)會(huì)影響第二階段DPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化[16]。

支架材料的結(jié)構(gòu)及形態(tài)會(huì)影響接種或歸巢于其表面及內(nèi)部的細(xì)胞行為。細(xì)胞外微環(huán)境同樣會(huì)對(duì)細(xì)胞次級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生作用,如細(xì)胞黏附分子受體、構(gòu)成成分、遷移軌跡、超細(xì)胞特征等，即材料對(duì)細(xì)胞的“接觸誘導(dǎo)”。關(guān)于細(xì)胞與不同表面及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的材料研究已相對(duì)深入,并建立多個(gè)有關(guān)“接觸誘導(dǎo)”的理論[17]。

例如研究將硅膠材料處理成具有小管狀的結(jié)構(gòu),在其上接種牙源性細(xì)胞,同時(shí)將牙源性細(xì)胞接種于光滑的硅膠材料表面,兩組細(xì)胞顯示出截然不同的膠原分泌能力及生物學(xué)行為:小管狀硅膠表面的牙源性細(xì)胞能夠進(jìn)入小管,與生理情況更為相似[18]。

本研究撓曲強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果表明,結(jié)合EDTA脫礦處理的冷凍干燥牙本質(zhì)基質(zhì)制備技術(shù)能夠保持與天然牙本質(zhì)相似的機(jī)械性能;組織學(xué)染色結(jié)果表明凍干處理前后牙本質(zhì)的組織學(xué)結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變;而良好的機(jī)械力學(xué)性能和適宜DPSCs生長(zhǎng)的微結(jié)構(gòu)均有利于提高組織工程牙再生的成功率。COL1釋放檢測(cè)結(jié)果及冷凍干燥原理提示FD保留了牙本質(zhì)中的生物活性物質(zhì),而細(xì)胞在凍干前后兩組牙本質(zhì)支架表面及在HA和玻片表面骨架蛋白形態(tài)的反差印證了材料結(jié)構(gòu)和生物活性物質(zhì)的保留對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的巨大影響。本研究研制的牙本質(zhì)生物活性材料為組織工程牙再生提供具有應(yīng)用前景的新型支架。另一方面,凍干技術(shù)使材料便于保存和運(yùn)輸,為組織工程牙庫(kù)的建立提供支持,其制備成本使牙庫(kù)的日常商業(yè)應(yīng)用成為可能,為牙組織工程的臨床轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。