紫葉稠李葉片對低溫環(huán)境的生理響應(yīng)

蔡建超，覃銀樸，馬 赫，崔金騰,2,3*，趙和文*

(1.北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院，北京102206；2.城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室，北京102206；3.北京市鄉(xiāng)村景觀規(guī)劃設(shè)計(jì)工程技術(shù)研究中心，北京102206)

紫葉稠李(Prunusvirginiana)為薔薇科稠李屬高大落葉喬木，株高可達(dá)10 m以上[1]，紫葉稠李初生葉為綠色，進(jìn)入4月后隨著溫度升高，逐漸轉(zhuǎn)為紅綠色至紫紅色，秋后變成紅色，是觀賞價(jià)值較高的彩葉樹種[2]。其適應(yīng)性、耐旱性、抗寒性強(qiáng)，且喜光、速生?？梢酝ㄟ^播種、嫁接和扦插繁殖，以嫁接成功率最高。經(jīng)苗木生產(chǎn)者引種栽培，在北方廣大地區(qū)已突顯其彩葉樹種的優(yōu)良特性[3-4]。目前，一些關(guān)于紫葉稠李耐寒性的報(bào)道多是通過引種地栽培的紫葉稠李生物學(xué)特性及生長表現(xiàn)的觀察定性描述[5]。楊艷清[1]進(jìn)行長春市引種紫葉稠李的生物學(xué)特性、生態(tài)學(xué)特性、生長節(jié)律及繁殖技術(shù)等研究。王秀蘭[6]研究引入沈陽的紫葉稠李小苗生物學(xué)特性、物候期、繁殖技術(shù)等方面的試驗(yàn)。紫葉稠李具有較強(qiáng)的耐寒性，本試驗(yàn)對紫葉稠李進(jìn)行低溫處理，研究低溫對花色素苷、葉綠素、類胡蘿卜素和可溶性糖積累的影響，以及相關(guān)酶活性變化規(guī)律，同時(shí)為低溫環(huán)境下紫葉稠李葉色變化的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取種植于北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院園林植物實(shí)踐基地的二年生紫葉稠李扦插苗。

1.2 低溫處理

5月初將綠葉期的紫葉稠李放于園林樓植物培養(yǎng)間，溫度15 ℃，光照強(qiáng)度15 000～20 000 lx，光照時(shí)間14 h光/10 h暗，分別于0、7、14、21、28、35、42 d采集枝條中部的葉片作為試驗(yàn)材料，設(shè)置5次重復(fù)；在園林植物實(shí)踐基地放置5盆常溫生長，光強(qiáng)相同的對照，其間對材料定期除草、澆水、施肥，保證長勢良好。

1.3 葉色參數(shù)測定

葉色參數(shù)測定采用柯尼卡美能達(dá)(中國)投資公司的色彩色差計(jì)(CR-400/410)，L*表示照度，相當(dāng)于亮度，a*表示從洋紅色至綠色的范圍，b*表示從黃色至藍(lán)色的范圍。L*的值域由0到100，表示由黑色向白色轉(zhuǎn)變。a*和b*的值域都是由-127至+128，由負(fù)值到正值，a*表示由綠色向紅色轉(zhuǎn)變；同樣原理，b*表示由藍(lán)色向黃色轉(zhuǎn)變，所有顏色就以這三個(gè)值交互變化組成。

1.4 色素含量測定

花色素苷采用鹽酸提取比色法測定，準(zhǔn)確稱取植物樣品0.50 g，置于具塞試管中，加0.1 mol/L鹽酸溶液20 mL，使樣品完全浸于溶液中，加塞，置于32 ℃恒溫箱中浸提4～8 h，取上清液裝入光徑1 cm的比色皿中，以0.1 mol/L鹽酸為空白對照，測量波長為530 nm的吸光值。葉綠素、類胡蘿卜素采用乙醇提取比色法測定，準(zhǔn)確稱取植物樣品0.20 g，放入研缽中，加少量石英砂和95%乙醇3 mL，研磨成勻漿，過濾到25 mL棕色容量瓶中，定容，取提液裝入光徑1 cm的比色皿中，以95%乙醇為空白對照，測量波長為470、649、665 nm的吸光值。設(shè)5次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 酶活性和可溶性糖測定

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法測定[7]，稱0.5 g樣品，加1 mL磷酸緩沖液(0.05 mol/L，pH=7.8)，冰浴研磨，研磨后加1 mL緩沖液，倒入離心管中，用2 mL緩沖液清洗研缽，倒入離心管中，平衡，低溫(0～4 ℃)離心20 min，離心后冷藏保存。取型號(hào)相同的試管，試管中加50 μL上清液(2支對照試管中各加磷酸緩沖液50 μL)，分別加3 mL反應(yīng)液，其中1支對照試管置于暗處，其余各管于4 000 lx日光下反應(yīng)20～30 min(要求各管受光情況一致，溫度高，時(shí)間縮短，低溫時(shí)延長)。反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對照管作空白，于560 nm下比色測定吸光度值。

過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[8]，取0.5 g樣品，切碎，放入研缽中，加適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管中，離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中。沉淀用5 mL磷酸緩沖液再提取2次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低溫下保存?zhèn)溆?。過氧化物酶活性測定的反應(yīng)體系：依次加入2.9 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液；1.0 mL 2% H2O2；1.0 mL 0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚和0.1 mL酶液。用加熱煮沸5 min的酶液為對照，反應(yīng)體系加入酶液后，立即于34 ℃水浴中保溫3 min，然后迅速稀釋1倍，470 nm波長下比色，每隔1 min記錄1次吸光度A470，共記錄5次。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)(A137)和多酚氧化酶(PPO)(A136)這2種酶活性采用南京建成生產(chǎn)的試劑盒測定。

可溶性糖含量(A145)采用南京建成生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，用SPSS 17.0(One-Way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫對紫葉稠李葉色參數(shù)的影響

對低溫處理環(huán)境下的紫葉稠李進(jìn)行葉色參數(shù)測定，葉色參數(shù)L*、a*、b*變化情況反映出葉色從低溫處理開始由綠變紫過程(圖1)。由圖2可知，L*值逐漸減小，減少了15.6，低溫處理0 d與處理42 d差異顯著；a*值從負(fù)到正，增加了17.3，處理0 d與處理42 d差異顯著；b*值逐漸減小，減少了21.3，處理0 d與處理42 d差異顯著。

注： A表示處理0 d，B表示低溫處理21 d，C表示低溫處理42 d。Note: A is 0 days of treatment, B is 21 days of low temperature treatment and C is 42 days of low temperature treatment.圖1 低溫處理下紫葉稠李的葉色變化Fig.1 Changes of leaf color in Prunus virginiana under low temperature treatment

圖2 低溫處理下的紫葉稠李葉色參數(shù)變化Fig.2 Leaf color parameters in Prunus virginiana under low temperature treatment

2.2 低溫對紫葉稠李葉片色素含量的影響

低溫處理后，紫葉稠李各色素含量變化趨勢見圖3?；ㄉ剀蘸壳捌谠鲩L緩慢，后期增長較快，雖在21 d時(shí)略有下降，但總體呈增長趨勢，增長了約19倍。葉綠素a、葉綠素b、葉綠素ab、類胡蘿卜素含量0至14 d時(shí)增長較快，之后增長緩慢，趨于平穩(wěn)，但在葉色變化過程中仍呈增長趨勢，都增長了約1.5倍。

2.3 低溫對紫葉稠李葉片酶活性和可溶性糖的影響

對低溫處理后紫葉稠李酶活性的影響見圖4。超氧化物歧化酶、多酚氧化酶活性隨時(shí)間增加呈先下降后上升再下降的變化趨勢，分別下降了70%和55%；過氧化物酶活性與兩者相反，呈先上升后下降再上升的變化趨勢，增加了約7.5倍；苯丙氨酸解氨酶活性變化趨勢與前者三個(gè)酶活性都不同，呈現(xiàn)先下降后上升的變化過程，稍有下降；代謝產(chǎn)物可溶性糖則一直處于上升的變化趨勢，增加了約12倍。

2.4 低溫處理與自然環(huán)境下紫葉稠李各種生理生化分析

對低溫處理與自然環(huán)境下紫葉稠李各種生理生化分析見表1。在0.01和0.05水平下，低溫處理植株葉色參數(shù)(L*、a*、b*)與自然環(huán)境植株差異不顯著，與對照植株差異顯著；低溫處理植株花色素苷含量顯著增加，增加了約3倍，與自然環(huán)境植株有顯著差異，與對照植株差異顯著；低溫處理植株葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著增加，分別增加了約1.5倍和1倍，與自然環(huán)境植株顯著差異。在0.01水平下，自然環(huán)境植株的葉綠素b與對照植株差異不顯著。

低溫處理紫葉稠李植株的過氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性與自然環(huán)境植株相比有顯著差異，其中過氧化物酶活性顯著高于自然環(huán)境植株和對照植株，是自然環(huán)境植株的34倍，是對照植株的7.5倍；多酚氧化酶活性顯著低于自然環(huán)境植株和對照植株，僅為自然環(huán)境植株的26%，與自然環(huán)境植株相比超氧化物歧化酶活性差異不顯著，且活性均顯著低于對照植株；可溶性糖含量顯著高于自然環(huán)境植株，約是自然環(huán)境植株的16倍。

2.5 低溫處理下紫葉稠李葉色參數(shù)、色素、酶活性相關(guān)性分析

低溫處理下紫葉稠李葉色參數(shù)、色素、酶活性相關(guān)性分析見表2。在0.05水平下，花色素苷與L*呈顯著負(fù)相關(guān)，與a*和葉綠素b呈顯著正相關(guān)；葉綠素a與a*、過氧化物酶、可溶性糖呈顯著正相關(guān)，與苯丙氨酸解氨酶呈顯著負(fù)相關(guān)；葉綠素b與類胡蘿卜素、過氧化物酶呈顯著正相關(guān)；葉綠素ab與a*、過氧化物酶、可溶性糖呈顯著正相關(guān)，與苯丙氨酸解氨酶呈顯著負(fù)相關(guān)；類胡蘿卜素與L*、b*、苯丙氨酸解氨酶呈顯著負(fù)相關(guān)。在0.01水平下，葉綠素a與L*、b*呈極顯著負(fù)相關(guān)，與類胡蘿卜素呈極顯著正相關(guān)；葉綠素b與可溶性糖呈極顯著正相關(guān)。

圖3 低溫處理下紫葉稠李葉片色素含量的變化Fig.3 Changes of pigment accumulation in Prunus virginiana under low temperature treatment

圖4 低溫對紫葉稠李的酶活性和代謝產(chǎn)物的影響Fig.4 Effects of low temperature on enzyme activity and metabolites of Prunus virginiana

表1 低溫處理與自然環(huán)境下紫葉稠李各種生理生化指標(biāo)分析Tab.1 Physiological and biochemical analysis of Prunus virginiana under low temperature and natural environment

注：表中數(shù)據(jù)后大寫字母表示顯著性水平為0.01，小寫字母表示顯著性水平為0.05；CK表示處理0 d，T1表示低溫處理42 d，T2表示自然環(huán)境生長42 d。

Note：The capital letters of the table indicate that the significance level was 0.01, and that of lowercase letters was 0.05；CK means 0 days of treatment, T1 means 42 days of low temperature treatment and T2 means 42 days of growth in natural environment.

表2 低溫處理下紫葉稠李酶活性以及色素的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis of enzymes activities and pigments in Prunus virginiana under low temperature treatment

注：*表示在0.05水平呈顯著相關(guān)性，**表示在0.01水平呈顯著相關(guān)性。

Note： * indicates a significant correlation at the 0.05 level, ** indicates a significant correlation at the 0.01 level.

3 討 論

溫度是影響植物生長發(fā)育重要的因子之一，在植物生長發(fā)育過程中的某些環(huán)節(jié)起著決定性的作用。目前，通過大量的試驗(yàn)研究人們對有關(guān)植物的抗寒性生理指標(biāo)及耐寒性機(jī)理有一定的認(rèn)識(shí)，植物經(jīng)過低溫脅迫后相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、脯氨酸、花色素苷和各種酶活性均發(fā)生不同程度的變化，改變植物在逆境(如強(qiáng)光和紫外線、干旱、低溫等)的抗逆性和防御性[9-11]。

本研究以紫葉稠李為試驗(yàn)材料，對低溫環(huán)境下葉色參數(shù)以及葉綠素、類胡蘿卜素和花色素苷含量的變化進(jìn)行分析。付全娟等[11]研究花色素苷在果樹抗逆中的作用，發(fā)現(xiàn)花色素苷的合成和積累有利于提高果樹的抗低溫能力，劉國君等[12]研究花色素苷含量與蘋果抗寒性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)抗寒性強(qiáng)的品種枝條中花色素苷含量高。本研究表明紫葉稠李低溫處理后隨著時(shí)間的增加花色素苷含量呈增加趨勢，花色素苷含量顯著高于對照植株，與前人研究結(jié)果一致。曾乃燕等[13]對水稻低溫脅迫光合色素的影響研究，得出低溫使光合色素含量降低。本研究表明葉綠素和類胡蘿卜素在低溫條件下含量升高，與前人的結(jié)果不一致，這可能由于物種不同導(dǎo)致?；ㄉ剀盏暮颗c葉綠素、類胡蘿卜素含量呈正相關(guān)，且與葉綠素b含量呈顯著正相關(guān)，表明花色素苷、葉綠素、類胡蘿卜素的積累提高紫葉稠李的抗寒能力，進(jìn)而調(diào)控紫葉稠李葉色變化。石進(jìn)朝等[14]研究發(fā)現(xiàn)，金銀木葉片內(nèi)可溶性糖含量隨著溫度降低而逐漸增加，姚小紅等[15]對彩葉扶桑葉色生理變化影響的分析發(fā)現(xiàn)，可溶性糖與花色素苷呈正相關(guān)。本研究通過對低溫處理和自然環(huán)境中紫葉稠李可溶性糖含量分析顯示紫葉稠李花色素苷合成與可溶性糖含量是顯著正相關(guān)，表明在花色素苷積累的過程中伴隨著可溶性糖的積累。

有研究結(jié)果證明，超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性與植物的抗寒性也有密切的關(guān)系[16-18]，對活性氧有清除作用，可維持活性氧動(dòng)態(tài)平衡，增強(qiáng)植物的抗逆性[19-21]。在低溫脅迫條件下超氧化物歧化酶對低溫的反應(yīng)較敏感，低溫脅迫強(qiáng)度較低時(shí)表現(xiàn)出較高的酶活性[22-23]。在較低強(qiáng)度(15 ℃)低溫處理?xiàng)l件下紫葉稠李，除多酚氧化酶外，超氧化物歧化酶、過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶活性都要高于自然環(huán)境條件下的酶活性，說明在低溫脅迫強(qiáng)度較低的情況下大部分酶能表現(xiàn)出較高的活性，和前人的研究結(jié)果一致，超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性增加可以增強(qiáng)紫葉稠李的抗逆性。劉鵬等[24]對低溫脅迫下外源水楊酸對栝樓幼苗抗寒性影響研究發(fā)現(xiàn)，低溫使多酚氧化酶活性增加。而本研究表明紫葉稠李在低溫脅迫下多酚氧化酶活性降低，與上述結(jié)果不一致，可能紫葉稠李存在特有的調(diào)控機(jī)制，具體原因有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)結(jié)果表明，紫葉稠李在低溫下體內(nèi)色素積累增加，可溶性糖含量升高，抗氧化酶等活性提高，一方面提高抗寒性，另一方面葉色發(fā)生變化，提高觀賞性。

紫葉稠李是一種有較強(qiáng)耐寒性的高大彩葉喬木，低溫并不影響其觀賞性，因此是北京增彩延綠工程的重要選材之一。本研究通過在模擬低溫環(huán)境分析紫葉稠李的耐寒適應(yīng)性以及同時(shí)期葉色變化規(guī)律，從生理生化變化機(jī)制角度對低溫和葉色調(diào)控機(jī)制之間的相互關(guān)系進(jìn)行分析，為今后提高紫葉稠李的引種適用性和觀賞性應(yīng)用提供理論依據(jù)。