PL-8家族透明質(zhì)酸酶的結(jié)構(gòu)特征及其催化作用機(jī)制

朱曉翠 宮倩紅

摘 要 透明質(zhì)酸酶是廣泛分布于自然界的一類糖苷酶，不僅能夠作為工具酶制備低分子量透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸寡糖，還可用于促進(jìn)藥物吸收以及創(chuàng)傷后局部水腫消散，因其多種生物學(xué)活性而廣泛應(yīng)用于工業(yè)和臨床。本文對PL-8家族細(xì)菌透明質(zhì)酸酶的三維結(jié)構(gòu)特征和底物的催化作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞 PL-8家族 透明質(zhì)酸酶 結(jié)構(gòu)特征 催化作用機(jī)制

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase， HAase）是一類能夠降解透明質(zhì)酸的糖苷酶，主要降解透明質(zhì)酸，同時(shí)能夠在一定程度上降解硫酸軟骨素（Chondroitin sulfates， CS）。透明質(zhì)酸酶由Duran-Reynals在1929年首次發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物睪丸及其他組織提取物中，可作為一種“擴(kuò)散因子”促進(jìn)疫苗、染料和毒素?cái)U(kuò)散。

基于氨基酸序列同源性分析，可以將透明質(zhì)酸酶分為兩大類：真核生物來源透明質(zhì)酸酶和原核生物來源透明質(zhì)酸酶。真核生物來源透明質(zhì)酸酶主要是從動(dòng)物組織器官（如牛、羊睪丸透明質(zhì)酸酶等）中提取，但動(dòng)物組織提取原料有限、純化工藝復(fù)雜、價(jià)格昂貴、而且存在病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)。原核生物透明質(zhì)酸酶主要來源于細(xì)菌和噬菌體中，來源廣泛，純化工藝簡單，成本較低，具有較好的市場應(yīng)用價(jià)值，因此細(xì)菌來源透明質(zhì)酸酶已成為目前的研究熱點(diǎn)。在CAZY數(shù)據(jù)庫中，細(xì)菌透明質(zhì)酸裂解酶主要?dú)w屬于PL-8和PL-16裂解酶家族，但兩個(gè)家族的透明質(zhì)酸酶在三維結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制方面存在明顯不同。本文主要對PL-8家族透明質(zhì)酸酶的三維結(jié)構(gòu)特征和底物的催化作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 PL-8家族三維結(jié)構(gòu)特征

PL-8家族是糖胺聚糖裂解酶家族，目前做過性質(zhì)研究的共有27種，主要包括透明質(zhì)酸酶、硫酸軟骨素酶和黃原膠酶。目前已經(jīng)闡明了PL-8家族多種透明質(zhì)酸酶的X射線晶體結(jié)構(gòu)，研究表明，PL-8家族細(xì)菌透明質(zhì)酸酶主要由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，分別是N端結(jié)構(gòu)域，間隔區(qū)和C端結(jié)構(gòu)域。其中結(jié)晶的天然肺炎鏈球菌酶分子由具有（%Z/%Z）5-6的%Z-螺旋桶結(jié)構(gòu)的主要催化結(jié)構(gòu)域和反平行%[折疊組成的C-末端結(jié)構(gòu)域組成。無乳鏈球菌（S. agalactiae）透明質(zhì)酸酶的結(jié)構(gòu)類似于肺炎鏈球菌（S. pneumoniae）透明質(zhì)酸酶，但N末端包含另外的結(jié)構(gòu)域，起到間隔結(jié)構(gòu)域的作用。C-末端%[-折疊結(jié)構(gòu)域的功能是調(diào)節(jié)聚合物HA/ Ch / ChS底物進(jìn)入%Z-螺旋催化結(jié)構(gòu)域中的催化裂縫，整個(gè)催化裂縫穿過%Z-螺旋區(qū)域，其中六糖單元?jiǎng)偤媒Y(jié)合在催化裂縫內(nèi)酶的活性位點(diǎn)存在于桶狀結(jié)構(gòu)的催化裂縫中，由三個(gè)殘基組成：Asn349，His399和Tyr408。

2底物結(jié)合裂縫

PL-8家族細(xì)菌透明質(zhì)酸裂解酶的共同結(jié)構(gòu)特征是它們都有一個(gè)細(xì)長的底物結(jié)合裂縫用于容納底物。在鏈球菌透明質(zhì)酸酶中就存在這樣的底物結(jié)合裂縫，該酶含有一個(gè)由%Z螺旋組成的扭曲的（%Z/%Z）5-6桶，底物結(jié)合裂縫嵌套在%Z螺旋中，促進(jìn)HA結(jié)合。在這些結(jié)構(gòu)中，裂縫由從%[-螺旋鏈的表面延伸的環(huán)組成。并且在幾種多糖水解酶中也發(fā)現(xiàn)了這種%[-螺旋折疊，例如鼠李糖半乳糖醛酸酶A和噬菌體P22的尾部刺突蛋白，這意味著裂縫特異的有利于多糖底物的結(jié)合。在一些酶中，裂縫被覆蓋以形成特異于細(xì)胞水解酶的結(jié)構(gòu)。這種裂縫的這一重要特征是它們主要具有正電性和疏水性，因此促進(jìn)帶負(fù)電荷的疏水性HA / Ch / ChS底物的結(jié)合。因此該過程由酶和聚合物的相互作用以及它們產(chǎn)生的電荷電勢驅(qū)動(dòng)，反應(yīng)的能量可能由糖苷鍵降解時(shí)發(fā)生的放熱反應(yīng)產(chǎn)生。

3催化作用機(jī)制

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PL-8家族透明質(zhì)酸酶的作用機(jī)制是%[-消除反應(yīng)，主要表現(xiàn)為質(zhì)子接受和捐贈(zèng)（Proton acceptance and donation， PAD）。

以鏈球菌透明質(zhì)酸酶為例，催化機(jī)制主要分為以下幾個(gè)步驟：（1）透明質(zhì)酸底物與酶的底物結(jié)合裂縫緊密結(jié)合;（2）通過透明質(zhì)酸酶的Asn作為電子吸收劑酸化HA的葡糖醛酸殘基的C5碳原子;（3）通過酶的His殘基奪走C5質(zhì)子，然后在糖苷鍵的還原側(cè)上的葡糖醛酸的C4和C5之間形成不飽和鍵;（4）從酶的Tyr殘基中提供質(zhì)子后裂解糖苷鍵;（5）最后，HA二糖產(chǎn)物從活性位點(diǎn)離開，并通過與水環(huán)境的酶交換平衡氫離子，然后酶用于下一輪催化。對于底物的逐步降解，HA通過一個(gè)二糖單元向鏈的還原端移位，并使用PAD機(jī)制進(jìn)行脫水降解。在該過程中，C4和C5碳原子從sp3變?yōu)閟p2雜交，其中糖環(huán)的產(chǎn)物構(gòu)象發(fā)生相應(yīng)的變化，最后變?yōu)榘胍问綐?gòu)象。除了三個(gè)催化殘基外，其他殘基還涉及酶作用的重要方面：疏水殘基Trp291，Trp292和Phe343，以及Glu388，Asp398和Thr400可能在裂縫末端產(chǎn)生負(fù)電位。與底物相互作用的疏水性區(qū)域發(fā)揮催化作用，而負(fù)電荷區(qū)域促進(jìn)產(chǎn)物的釋放。

4展望

關(guān)于透明質(zhì)酸酶的研究已有80余年的歷史，因其具有多種生物學(xué)活性，透明質(zhì)酸酶已被廣泛應(yīng)用于工業(yè)和醫(yī)療領(lǐng)域，如制備透明質(zhì)酸寡糖、眼科治療、美容整形和促進(jìn)藥物擴(kuò)散等。由于細(xì)菌透明質(zhì)酸酶來源廣泛，純化工藝簡單，且生產(chǎn)成本較低，因此成為近年來的研究熱點(diǎn)之一。但有關(guān)細(xì)菌來源透明質(zhì)酸酶的催化作用機(jī)制、底物特異性和促進(jìn)皮下藥物擴(kuò)散的作用仍有待深入研究。相信隨著研究的進(jìn)一步深入，細(xì)菌來源透明質(zhì)酸酶將為皮下藥物擴(kuò)散和腫瘤靶向治療帶來新的希望。