福建省泉州地區(qū)新生兒有機(jī)酸血癥的發(fā)病率與疾病譜篩查結(jié)果分析 *

鐘錦平，傅清流，林壹明

(泉州市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建泉州 362000)

有機(jī)酸血癥(organic academia，OA)是一組由于氨基酸、糖酵解及脂肪氧化代謝途徑中某種酶的缺陷，導(dǎo)致中間代謝產(chǎn)物有機(jī)酸蓄積的疾病[1]。該病臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，診斷缺乏特異性，有機(jī)酸大量蓄積會(huì)導(dǎo)致患兒出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)及其他臟器損害，給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。臨床上該組疾病可以通過尿氣相色譜質(zhì)譜分析技術(shù)檢出，但多數(shù)患兒由于診斷延遲往往已錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)，且OA在臨床高危的遺傳代謝病患兒中所占的比例較高[2]。若能早期診斷OA并進(jìn)行及時(shí)的干預(yù)治療可以有效改善預(yù)后，但由于尿氣相色譜質(zhì)譜分析技術(shù)操作繁瑣，通量低，難以進(jìn)行大規(guī)模的篩查。因此，基于串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的新生兒篩查尤為重要[3]，目前國(guó)內(nèi)報(bào)道OA疾病譜多數(shù)來自臨床高危病人，較少關(guān)于新生兒篩查的OA疾病譜報(bào)道。為了解福建省泉州地區(qū)OA的發(fā)病率及疾病譜特征，本研究總結(jié)泉州地區(qū)5年的OA新生兒篩查數(shù)據(jù)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 2014年1月～2018年11月在泉州市兒童醫(yī)院新生兒疾病篩查中心進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜遺傳代謝病篩查的新生兒共計(jì)364 545例，其中男性209 136例，女性155 409例。本研究經(jīng)醫(yī)院學(xué)術(shù)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有受試者的父母或監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 新生兒非衍生法篩查試劑盒為芬蘭Perkin Elmer公司生產(chǎn)的試劑：NeoBaseTMNon-derivatized MSMS Kit；TQD串聯(lián)質(zhì)譜儀購(gòu)自美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及新生兒篩查：采集新生兒足跟血4滴滴于專用濾紙片上，室溫下自然晾干后冷鏈遞送至篩查中心。干血滴濾紙片經(jīng)由含有氨基酸和?；鈮A內(nèi)標(biāo)的有機(jī)溶劑萃取后，應(yīng)用TQD串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行氨基酸和?；鈮A分析。新生兒遺傳代謝病篩查異常進(jìn)行召回復(fù)查，結(jié)果仍異常的患兒進(jìn)行進(jìn)一步的確診分析。

1.3.2 基因檢測(cè)及診斷：基因檢測(cè)送至杭州博圣生物技術(shù)有限公司，采用高通量的測(cè)序方法對(duì)OA的相關(guān)基因進(jìn)行靶向捕獲及檢測(cè)。首先提取可疑陽(yáng)性患兒的基因組DNA樣本，利用超聲將DNA打斷成主峰為150～200 bp的彌散小片段。接著采用捕獲oligo通過多重PCR方法靶向富集目標(biāo)區(qū)域基因組序列，并純化捕獲產(chǎn)物構(gòu)建文庫(kù)。利用建庫(kù)試劑盒處理純化產(chǎn)物，用Qubit測(cè)定文庫(kù)濃度并對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢，確保打斷的片段在250～350 bp左右，沒有接頭片段。最后利用定量試劑盒對(duì)文庫(kù)進(jìn)行精確定量，變性稀釋至上機(jī)要求濃度后在MiSeq(Illumina)測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析。對(duì)所有發(fā)現(xiàn)的變異都應(yīng)用Sanger測(cè)序進(jìn)行位點(diǎn)驗(yàn)證。若患兒的等位基因同時(shí)出現(xiàn)基因突變則為確診的OA患兒。

2 結(jié)果

2.1 篩查概況 見表1。364 545例篩查的新生兒中，經(jīng)過基因檢測(cè)明確診斷OA患兒39例，其中男性16例，女性23例，總發(fā)病率為1∶9 347。確診OA共7種，其中最常見的為2-甲基丁酰輔酶A 脫氫酶缺乏癥12例(30.8%)，其次為戊二酸血癥I型7例(17.9%)，其余的分別為異丁酰輔酶A脫氫酶缺乏癥6例(15.4%)、3-甲基巴豆酰輔酶A脫氫酶缺乏癥5例(12.8%)、異戊酸血癥4例(10.3%)、甲基丙二酸血癥3例(7.7%)和丙酸血癥2例(5.1%)。此外，本研究檢出4例母源性O(shè)A，分別為戊二酸血癥I型和3-甲基巴豆酰輔酶A脫氫酶缺乏癥各2例。

表1 泉州地區(qū)39例OA患兒的新生兒篩查結(jié)果

2.2 不同地區(qū)的OA發(fā)病率及疾病譜 見表2。不同國(guó)家和地區(qū)OA的發(fā)病率和疾病譜有明顯差異。如美國(guó)北卡羅來納州[4]最常見的3種OA為3-甲基巴豆酰輔酶A脫氫酶缺乏癥、甲基丙二酸血癥和異戊酸血癥。澳大利亞[5]排名前三的OA為3-甲基巴豆酰輔酶A脫氫酶缺乏癥、戊二酸血癥I型和丙酸血癥。我國(guó)浙江省[6]最常見的OA則為甲基丙二酸血癥，其次為3-甲基巴豆酰輔酶A脫氫酶缺乏癥。與這些研究相似的是，本研究戊二酸血癥I型和3-甲基巴豆酰輔酶A脫氫酶缺乏癥也較為常見。而明顯不同的是，其他研究常見的甲基丙二酸血癥在本研究中卻很少見，而本研究最常見的OA為2-甲基丁酰輔酶A脫氫酶缺乏癥，異丁酰輔酶A脫氫酶缺乏癥也比較常見。

表2 不同地區(qū)OA患兒的新生兒篩查結(jié)果

3 討論

本研究總結(jié)了福建泉州及其他地區(qū)新生兒OA的發(fā)病率和疾病譜，結(jié)果顯示泉州地區(qū)OA的總發(fā)病率高于美國(guó)、澳大利亞等國(guó)家和浙江地區(qū)。值得注意的是，除了地區(qū)和種族差異外，篩查參考值的設(shè)定和篩查病種的制定也會(huì)影響OA的檢出率。不同國(guó)家和地區(qū)的OA疾病譜有明顯差異，其中本研究常見的2-甲基丁酰輔酶A 脫氫酶缺乏癥和異丁酰輔酶A脫氫酶缺乏癥在其他地區(qū)鮮有報(bào)道。

2-甲基丁酰輔酶A脫氫酶缺乏癥是一種由于L-異亮氨酸代謝障礙導(dǎo)致2-甲基丁酰甘氨酸等相關(guān)代謝產(chǎn)物在體內(nèi)蓄積的有機(jī)酸代謝病。GIBSON等[7]于1999年報(bào)道了全球首例2-甲基丁酰輔酶A 脫氫酶缺乏癥患兒，是一位患有神經(jīng)發(fā)育障礙的兒童。在串聯(lián)質(zhì)譜篩查之前，該病的臨床表現(xiàn)主要為病例報(bào)告，患兒可出現(xiàn)包括發(fā)育遲緩、智力低下、驚厥、肌肉萎縮、肌張力低下和孤僻行為等臨床癥狀。近年來隨著串聯(lián)質(zhì)譜新生兒疾病篩查的廣泛開展，各個(gè)國(guó)家陸續(xù)報(bào)道了不同種族的2-甲基丁酰輔酶A 脫氫酶缺乏癥患兒，其中大部分新生兒篩查或者家系篩查發(fā)現(xiàn)的患兒暫無明顯臨床癥狀[8]。2013年，VAN CALCAR等[9]系統(tǒng)分析了美國(guó)威斯康星州10年的新生兒篩查數(shù)據(jù)，共發(fā)現(xiàn)92例患兒，其中90例都來自苗族，該州苗族人群發(fā)病率高達(dá)1∶132，而非苗族人群的發(fā)病率則為1∶540 780。而國(guó)內(nèi)僅見湖南沈玉燕等[10]報(bào)道了5例患兒，初步估計(jì)總發(fā)病率為1∶10 219。本研究應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已完成約36萬例樣本檢測(cè)，迄今發(fā)現(xiàn)了12例漢族患兒，預(yù)示著該病在漢族人群發(fā)病率并不低。目前該病尚未納入我國(guó)新生兒篩查規(guī)定病種，因此本研究結(jié)果可為篩查病種的制定與實(shí)施提供參考依據(jù)。

異丁酰輔酶A脫氫酶缺乏癥是由于異丁酰基輔酶A脫氫酶編碼基因突變引起纈氨酸代謝障礙造成丁酰肉堿等物質(zhì)蓄積的一種代謝障礙疾病[11]。ROE等[12]于1998年報(bào)道了全球首例異丁酰輔酶A脫氫酶缺乏癥患兒，是一個(gè)西班牙裔的2歲女孩，11個(gè)月大時(shí)出現(xiàn)發(fā)育遲緩、貧血、心肌病變和繼發(fā)性肉堿缺乏，通過補(bǔ)充左卡尼汀治療，隨訪至6歲生長(zhǎng)發(fā)育正常。直到2002年，NGUYEN等[13]才闡明了該病的分子致病機(jī)制，明確致病基因?yàn)锳CAD8(MIM 604773)。2004年，BATTAILE等[14]闡明了異丁酰輔酶A脫氫酶的蛋白三維結(jié)構(gòu)，并分析三個(gè)ACAD8基因突變?nèi)绾斡绊懙鞍捉Y(jié)構(gòu)和功能。此后，國(guó)際上陸陸續(xù)續(xù)有關(guān)于異丁酰輔酶A脫氫酶缺乏癥的報(bào)道，但關(guān)于該病的具體發(fā)病率目前尚不清楚，OGLEABEE等[15]初步估計(jì)其發(fā)病率高于1∶70 000，GALLANT等[16]報(bào)道了美國(guó)加利福尼亞的發(fā)病率為1∶292 451。而國(guó)內(nèi)目前尚無關(guān)于異丁酰輔酶A脫氫酶缺乏癥篩查的研究報(bào)道，而本研究首次在國(guó)內(nèi)闡明了該病的發(fā)病率，可為臨床診斷及干預(yù)提供參考依據(jù)，有助于提高兒科醫(yī)生對(duì)該病的認(rèn)識(shí)及鑒別診斷能力，從而避免誤診。

在多數(shù)研究中常見的經(jīng)典OA如甲基丙二酸血癥和丙酸血癥在本研究中卻很少見。甲基丙二酸血癥在北方的發(fā)病率較高，如山東省的發(fā)病率高達(dá)1∶3 920[17]。本研究?jī)H檢出3例甲基丙二酸血癥，而浙江省最常見的甲基丙二酸血癥的發(fā)病率為1∶46 500，也明顯低于山東的報(bào)道，提示該病可能存在地區(qū)差異性且呈北高南低的趨勢(shì)。戊二酸血癥I型是本研究第二常見的OA，據(jù)報(bào)道90%的患兒在早期會(huì)并發(fā)急性腦病，通過新生兒篩查早期診治可明顯減少患兒的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，從而避免不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)損害。結(jié)合戊二酸血癥I型在本地區(qū)的高發(fā)病率及臨床癥狀較嚴(yán)重，對(duì)該病應(yīng)引起足夠的重視，避免漏篩。3-甲基巴豆酰輔酶A脫氫酶缺乏癥是多個(gè)國(guó)家新生兒篩查最常見的OA，該病被認(rèn)為是相對(duì)良性的疾病，但仍有10%～15%的患兒會(huì)出現(xiàn)乏力、嘔吐和喂養(yǎng)困難等臨床癥狀，應(yīng)注意進(jìn)行長(zhǎng)期的隨訪。此外，本研究發(fā)現(xiàn)了4例母源性O(shè)A，目前對(duì)于新生兒篩查發(fā)現(xiàn)的母源性病例報(bào)道較少且尚無統(tǒng)一的管理規(guī)范，這種情況下小孩往往只是攜帶者，應(yīng)注意鑒別診斷。

綜上所述，本研究系統(tǒng)回顧分析了福建省泉州地區(qū)OA的新生兒篩查概況，泉州地區(qū)OA的總發(fā)病率較高，OA疾病譜與其他地區(qū)不同，最常見的三種OA為2-甲基丁酰輔酶A 脫氫酶缺乏癥、戊二酸血癥I型和異丁酰輔酶A脫氫酶缺乏癥。OA臨床異質(zhì)性大，發(fā)病率及疾病譜的闡明將為本地區(qū)的新生兒篩查提供科學(xué)依據(jù)與指導(dǎo)。